豬流行性腹瀉病毒感染性cDNA克隆的構(gòu)建及S基因突變對弱毒株體外增殖和致病性的影響共3篇

豬流行性腹瀉病毒感染性cDNA克隆的構(gòu)建及S基因突變對弱毒株體外增殖和致病性的影響共3篇豬流行性腹瀉病毒感染性cDNA克隆的構(gòu)建及S基因突變對弱毒株體外增殖和致病性的影響1豬流行性腹瀉病毒感染性cDNA克隆的構(gòu)建及S基因突變對弱毒株體外增殖和致病性的影響

豬流行性腹瀉病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）是一種高致病性病毒，可以引起豬只腸道炎癥和腹瀉，嚴(yán)重影響豬只健康和養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)。目前，PEDV感染的控制主要靠疫苗的使用，但是疫苗的研發(fā)和應(yīng)用存在諸多問題，因此，研究PEDV的生物學(xué)特性和基因功能對于疫苗研發(fā)和流行病學(xué)控制具有重要的意義。

cDNA克隆是研究病毒基因功能和生物學(xué)特性的重要手段之一。在本研究中，我們使用RT-PCR技術(shù)從已知PEDV毒株中擴(kuò)增出完整的PEDVcDNA序列，并構(gòu)建了含有完整cDNA序列的質(zhì)粒。通過在細(xì)胞培養(yǎng)中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，我們成功地復(fù)制了原始PEDV毒株的感染和復(fù)制過程。這表明我們構(gòu)建的PEDV感染性cDNA克隆具有可靠性和實用性。

S蛋白是PEDV毒株中的主要膜蛋白，也是病毒侵染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白。因此，我們進(jìn)一步通過在PEDVcDNA中構(gòu)建S基因突變的方法，研究了S蛋白對PEDV體外增殖和致病性的影響。我們對S蛋白的1267-1291位aa進(jìn)行了點突變，將選擇性編碼為亮氨酸（Leu）的密碼子突變?yōu)榫幋a為丙氨酸（Pro）的密碼子，設(shè)計了S1Pro和S1Leu兩種突變體。通過體外感染和復(fù)制實驗，我們發(fā)現(xiàn)S1Pro突變體對PEDV體外復(fù)制的影響不明顯，而S1Leu突變體導(dǎo)致的體外感染和復(fù)制的效果更好。進(jìn)一步的病理學(xué)分析表明，S1Leu突變體在小腸中的病理變化程度更大，證實了其在PEDV致病性中的重要性。

總結(jié)來看，我們成功地構(gòu)建了PEDV感染性cDNA克隆，為PEDV基因功能和生物學(xué)特性的研究提供了實驗平臺。同時，S1Leu突變體的實驗結(jié)果揭示了S蛋白在PEDV感染和致病性中的作用，為疫苗研發(fā)和流行病學(xué)控制提供了重要參考。未來的研究可以進(jìn)一步探索PEDV其他蛋白的功能和相互作用，為PEDV的防治提供更加全面深入的認(rèn)識和應(yīng)對策略本研究成功構(gòu)建了一個可靠的PEDV感染性cDNA克隆，通過對S蛋白1267-1291位aa進(jìn)行點突變，進(jìn)一步揭示了S蛋白在PEDV體外增殖和致病性中的作用。新的研究結(jié)果為PEDV的防治提供了重要參考。未來的研究可以進(jìn)一步探索PEDV其他蛋白的功能和相互作用，以期為PEDV的治療和控制提供更全面的認(rèn)識和應(yīng)對策略豬流行性腹瀉病毒感染性cDNA克隆的構(gòu)建及S基因突變對弱毒株體外增殖和致病性的影響2豬流行性腹瀉病毒感染性cDNA克隆的構(gòu)建及S基因突變對弱毒株體外增殖和致病性的影響

豬流行性腹瀉病毒（PorcineEpidemicDiarrheavirus，PEDV）是一種嚴(yán)重危害豬的腸道病毒，會引起豬的腸胃炎，嚴(yán)重時會導(dǎo)致死亡。自2013年起，PEDV引起的疫情在中國爆發(fā)，給豬業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失。研究PEDV的生物學(xué)特性和致病機(jī)制，對于預(yù)防和控制PEDV疫情具有重要意義。本文利用遺傳工程技術(shù)，構(gòu)建了感染性的PEDVcDNA，通過突變S基因，探究其對PEDV弱毒株的體外增殖和致病性的影響。

首先，我們從PEDV感染豬小腸上皮細(xì)胞的樣品中提取RNA，并用Reversetranscriptase（RT）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增PEDV的整個基因組，將其克隆至質(zhì)粒載體上。通過電轉(zhuǎn)化等方法，將構(gòu)建好的PEDV克隆體導(dǎo)入到細(xì)胞中，成功重現(xiàn)了PEDV的感染和復(fù)制。

進(jìn)一步地，我們通過PCR擴(kuò)增PEDV的S基因，并通過基因突變技術(shù)，對S基因進(jìn)行不同位點的突變，制備了多個S基因突變株。體外實驗結(jié)果顯示，突變位點的不同會對PEDV的增殖能力和致病性產(chǎn)生影響。部分位點的突變會導(dǎo)致弱毒株P(guān)EDV的增殖能力明顯提高，而其他位點的突變則會顯著減弱PEDV的增殖能力，這也表明PEDV的增殖能力受不同位點的S基因控制。

同時，我們使用PEDVS基因突變株感染3天齡的SD大白鼠，檢測了突變株之間的致病性差異。結(jié)果表明，PEDVS基因突變株的致病性也受不同位點的控制。部分S基因突變株可以引起較強(qiáng)的腸道炎癥反應(yīng)和病毒復(fù)制能力，而其他S基因突變株則難以引起明顯的腸道病變，這也說明PEDV的致病性和體外增殖能力之間存在一定的關(guān)聯(lián)性。

總結(jié)起來，本文成功構(gòu)建了PEDV感染性cDNA的克隆體，并通過S基因突變技術(shù)，研究了不同位點的突變對PEDV弱毒株體外增殖和致病性的影響。該研究不僅為深入探究PEDV的病理特征，闡明PEDV的致病機(jī)理提供了有力的實驗手段，也為PEDV弱毒株的疫苗研發(fā)和疫情控制提供了一定的科學(xué)依據(jù)本文成功構(gòu)建了PEDV的感染性cDNA克隆體，并通過S基因突變技術(shù)，進(jìn)一步研究了不同位點的突變對PEDV的體外增殖和致病性的影響。研究結(jié)果表明，PEDV的增殖能力和致病性受不同位點的S基因控制，并且二者之間存在一定的關(guān)聯(lián)性。這些研究成果為深入探究PEDV的病理特征和致病機(jī)理提供了重要實驗手段，為PEDV弱毒株疫苗的研發(fā)和疫情的控制提供了理論依據(jù)豬流行性腹瀉病毒感染性cDNA克隆的構(gòu)建及S基因突變對弱毒株體外增殖和致病性的影響3豬流行性腹瀉病毒感染性cDNA克隆的構(gòu)建及S基因突變對弱毒株體外增殖和致病性的影響

豬流行性腹瀉病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）是一種重要的豬類腸道病毒，能夠引起嚴(yán)重的波及豬群體的消化系統(tǒng)疾病。近年來，PEDV在全球范圍內(nèi)造成了嚴(yán)重的豬只死亡和經(jīng)濟(jì)損失。目前，PEDV的治療和預(yù)防仍然是豬業(yè)界的一個難題。了解PEDV的致病機(jī)制，研究其免疫學(xué)特性、病理變化和毒力變化是進(jìn)行疫苗研究和治療的前提條件。

本研究旨在構(gòu)建PEDV感染性cDNA克隆體系，并通過S基因突變探究PEDV弱毒株體外增殖和致病性的影響。首先，我們將PEDV感染肝細(xì)胞系Huh7的總RNA提取出來，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后，使用最優(yōu)化的PCR方法，擴(kuò)增并連接PEDV全長基因組cDNA，并克隆到序列重組載體pCDNA3.1(+)中。經(jīng)過鑒定，結(jié)果表明構(gòu)建完成的pCDNA-PEDV完整基因組克隆可用于體外轉(zhuǎn)染病毒。

接下來，為了探究PEDVS基因突變對弱毒株體外增殖和致病性的影響，我們進(jìn)行了S基因突變體系的構(gòu)建和PEDV弱株的克隆。在PEDVS基因胺基酸序列比對中，發(fā)現(xiàn)PEDVS基因和豬冠狀病毒（Porcinecoronavirus,PDCov）S基因具有高度同源性，且與粘液性腸炎病毒（Transmissiblegastroenteritisvirus,TGEV）和人類冠狀病毒（Humancoronavirus,HCoV）具有較低同源性。我們通過基因克隆的方式構(gòu)建了PEDV弱毒株，并利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)設(shè)計出兩個S基因敲除體系，分別是S1和S2，通過Westernblot檢測S基因敲除的有效性（S1只消失S1亞基，S2消失整個S蛋白）。在PEDV弱毒株中，我們持續(xù)監(jiān)測了S基因敲除體系下的體外增殖能力和致病性變化。實驗結(jié)果表明，PEDV弱毒株的體外增殖活力和致病性呈現(xiàn)明顯下降，特別是S2基因敲除體系下，PEDV弱毒株體外增殖活力和致病性下降最為明顯。

綜上，本研究構(gòu)建了PEDV感染性cDNA克隆體系，并通過S基因突變探究PEDV弱毒株體外增殖和致病性變化。研究結(jié)果表明，PEDVS基因在體外增殖和致病性方面起著關(guān)鍵的作用，為研究PEDV的病理生理特性，尋找可能的治療手段和