第十章基因工程的應(yīng)用

第十章基因工程的應(yīng)用第1頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二專一改變基因中某一個或某些特定氨基酸的技術(shù)。二、定點突變（site-specificmutagenesis）加拿大科學(xué)家MichaelSmith1985年建立，并與1993年獲Nobel化學(xué)獎。第2頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二1.M13DNA進行的寡核苷酸介導(dǎo)誘變（1）條件①所要改變的基因編碼區(qū)的精確的核苷酸序列。②所要引入的氨基酸變化。（2）方法①取得目的基因。GGCTTACCGAAT5’5’3’3’第3頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二②插入到雙鏈形式的M13噬菌體載體中③分離出M13正鏈重組載體GGCTTACCGAATGGCTTA第4頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二④合成帶有突變核苷酸的目的基因寡核苷酸片段CCGAAG5’3’⑤帶有突變核苷酸的寡核苷酸片段與M13（+）鏈復(fù)性。錯配的核苷酸位于片段的中部，以利于復(fù)性雜交。GGCTTACCGAA5’3’G第5頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二⑥以寡核苷酸鏈作引物，以M13（+）作模板,用Klenow片段合成M13（-）鏈。GGCTTAGCCGAA5’3’⑦用T4DNA連接酶連接結(jié)成完整的雙鏈GGCTTACCGAAG第6頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二⑧轉(zhuǎn)化大腸桿菌，噬菌體DNA在大腸桿菌中擴增，形成一半野生型M13雙鏈DNA，一半突變型M13雙鏈DNA噬菌體。野生型CCGAAG誘變型GGCTTCGGCTTACCGAAT（M13的復(fù)制型是雙鏈環(huán)狀DNA）。母鏈第7頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二（3）缺點：⑨分離提取M13雙鏈DNA，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用寡聚核苷酸探針挑選突變型載體克隆。⑩切下突變基因，接到表達載體中表達誘變的蛋白質(zhì)。通常只有1%-5%的噬菌斑含有突變的基因。（4）改進：目的基因插入雙鏈形式的M13噬菌體后，轉(zhuǎn)入特殊的受體菌株中。第8頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二2.寡核苷酸介導(dǎo)的PCR誘變（1）方法①將目的基因克隆到質(zhì)粒上。②在欲突變的位置上設(shè)計兩對引物，分別帶有兩條鏈的突變核苷酸。第9頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二ATGCATGCATGCATGCTACGTACGTACGTACGATGAATGCATGCTACGATGCATGCATGCATGCTACGTACGTACGTACGCATGCTACGTACTTACP1P2P3P4第10頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二③分別進行PCR，擴增出線性的全長質(zhì)粒。但兩組PCR產(chǎn)物的末端位置不同。TACTTACGTACGATGCATGAATGCATGCTACGGTACGATGCATGAATGTACGTACTTACCATGC④PCR產(chǎn)物變性成單鏈，混合后復(fù)性，形成具有粘性末端的雜交雙鏈（1-4；2-3）。1234第11頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二TACTTACGTACGTACGGTACGTACGTACTTACATGCATGAATGCATGCATGCATGAATGCATGC⑤環(huán)化成有兩個切口的開環(huán)質(zhì)粒。用連接酶連接或直接轉(zhuǎn)入細菌（細菌會修復(fù)切口）。1423粘性末端粘性末端第12頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二第13頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二3.改進型雙引物誘變方法（是目前較常用的方法之一）：①目的基因克隆到M13噬菌體載體中。②分離提取M13單鏈DNA作模板。③設(shè)計兩個不同區(qū)段的PCR引物，延伸方向一致，其中一個引物的5’端磷酸化。引物1上引入突變核苷酸。引物2對應(yīng)于載體上的一個單一酶切位點，并將這個位點突變一個核苷酸，使內(nèi)切酶無法識別。（一般設(shè)計在抗菌素抗性基因內(nèi)）。第14頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二ATGCATGCATGCATGCTACTTACGTACG欲突變的位點引物1CTGGAATTCATGCGACGACCTTAAATACG引物2單一酶切位點P磷酸化④用DNA聚合酶延伸后用T4DNA連接酶連接成雜交雙鏈。第15頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二ATGCATGCATGCATGCTACTTACGTACGCTGGAATTCATGCGAC⑤用引物2對應(yīng)的單一限制性內(nèi)切酶切雜交雙鏈，會得到模板鏈被切開一個口但新生的鏈完整的雜交雙鏈環(huán)。EcoRI酶切口⑥轉(zhuǎn)化修復(fù)缺陷型大腸桿菌。GACCTTAAATACG第16頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二4.重疊延伸誘變⑦模板鏈由于已經(jīng)成為線性分子，且又不能被修復(fù)，所以不能在菌體內(nèi)穩(wěn)定存在，只剩下新生的突變鏈在菌體內(nèi)復(fù)制。①目的基因克隆到載體上（不一定是M13）。②設(shè)計兩對引物：引物1和引物2是目的基因兩端的載體上的通用引物；引物3和引物4是與突變位點對應(yīng)的反向互補序列。第17頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二12CTGCTACGGGACGATGCCCTGCTGCGGGACGACGCC引物3引物4⑤分別以引物1、4和引物2、3為組合進行PCR。結(jié)果形成帶有突變的基因的左右兩個部分。GACGACGCCCTGCTGCGG14CTGCTGCGG3GACGACGCC2第18頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二⑥兩組PCR產(chǎn)物混合后變性、復(fù)性，可能形成下列兩種雜交鏈，其中一種復(fù)性方式能夠進一步在3’端繼續(xù)延伸，補足全長基因序列。1G4C2C3G不能延伸能延伸1G2C帶突變的全長基因第19頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二⑦除去多余的引物，用通用引物1、2依次為模板進行PCR擴增。得到含有預(yù)期突變位點的基因。1G2C12⑧插入載體進行表達突變的產(chǎn)物。第20頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)基因工程生產(chǎn)抗體每一種生物的生命都始終經(jīng)受著其他物種的威脅。——自然法則之一第21頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二一、抗體（antibody）1.脊椎動物的免疫系統(tǒng)有三種基本的工作形式：（1）細胞免疫（cellularimmunity）T細胞中的一類（KillerTcell）殺死被病原感染的細胞。T細胞中的另一類（HelperTcell）對病原做出反應(yīng)，分泌蛋白質(zhì)（淋巴因子）刺激機體作出整體反應(yīng)（如產(chǎn)生巨噬細胞等）。（2）淋巴免疫（3）體液免疫B細胞分泌抗體與病原結(jié)合。第22頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二第23頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二二、抗體的結(jié)構(gòu)和功能（1）抗體的結(jié)構(gòu)有兩條相同的重鏈（H）和兩條相同的輕鏈（L）組成的Y字形四聚體。第24頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二（2）抗體各部位的功能①抗體的抗原識別位點位于H鏈和L鏈的N端（Y字形的支角上）。②恒定區(qū)（C區(qū)）有三個互補決定區(qū)（CDR）組成，這三個CDR都位于H鏈和L鏈的N端的可變區(qū)內(nèi)（VH、VL）重鏈上有3個（CH1、CH2、CH3），輕鏈上有1個（CL）。不同的抗體分子的恒定區(qū)的差異只有一個或兩個氨基酸。第25頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二抗體分子的空間結(jié)構(gòu)第26頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二（3）木瓜蛋白酶處理后的抗體的結(jié)構(gòu)木瓜蛋白酶可將抗體分解成3各部分：①兩個Fab片段：屬于Y字形的兩個角。包含完整的L鏈和H鏈的VH和CH1②一個Fc片段是Y字形的柄部。包括兩條重鏈的CH2和CH3第27頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二第28頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二（4）Fab和Fc片段的功能①Fab具有抗原結(jié)合活性和特異性。其實只要Fab上的VH和VL（合稱Fv片斷）即可。②Fc片段沒有抗原結(jié)合活性，但它是抗原結(jié)合到抗體上后激發(fā)機體免疫反應(yīng)的主要部位。第29頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二三、抗體的表達系統(tǒng)1.在重組噬菌體中篩選生產(chǎn)抗體（1）原理：抗體分子的Fab（Fv片段）是抗原的結(jié)合區(qū)。Fv片段編碼重鏈和輕鏈的基因形成任意組合，然后檢測他們與所需抗原的結(jié)合能力。（2）克隆載體分別克隆H鏈和L鏈的Fv片段，形成兩種鏈的cDNA文庫。載體或M13載體。第30頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二絲狀噬菌體（單鏈環(huán)狀DNA）。如M13、fd、f1等。（3）表達載體第31頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二Filamentousphagefd第32頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二g3p：外殼蛋白3；其余類似。第33頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二（3）方法噬菌體展示（Phagedisplay）：將外源蛋白（多肽、酶、抗體、DNA結(jié)合蛋白）結(jié)合到噬菌體的外殼蛋白上形成融合蛋白，表達于噬菌體的外表面。細菌表面展示（Bacteriasurfacedisplay）第34頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二①從經(jīng)過免疫的小鼠或人的B細胞中分離mRNA（既有重鏈也有輕鏈的mRNA）。②反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。③設(shè)計一對重鏈的引物和一對輕鏈的引物，通過PCR將重鏈和輕鏈的cDNA擴增。④用特定的限制性內(nèi)切酶切PCR產(chǎn)物。第35頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二⑦輔助M13噬菌體：噬菌體外殼蛋白基因完整。⑧從H鏈文庫和L鏈文庫中隨機切出H鏈和L鏈片段，把酶切后的H鏈和L鏈片斷連接，隨機克隆到M13載體的外殼蛋白3（或8）下游，形成融合蛋白文庫。（抗體組合文庫）⑤把重鏈和輕鏈的cDNAPCR片段分別克隆到克隆載體中，制成cDNA文庫。⑥構(gòu)建M13載體：只包含外殼蛋白3（或8基因）、細菌和病毒復(fù)制起點。第36頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二⑩提取各噬菌斑的重組噬菌體顆粒，與抗原進行親和分析，尋找結(jié)合力最強的噬菌體。⑾分析親和力強的載體上的抗體基因組合序列，轉(zhuǎn)到其他的表達載體上表達。⑨重組載體與輔助載體共同感染細菌，形成有重組的M13外殼（3蛋白或8蛋白上連著抗體片段）的M13（內(nèi)部所包裝的DNA絕大多數(shù)是載體，輔助載體DNA復(fù)制效率差）。第37頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二第38頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二第三節(jié)基因工程生產(chǎn)疫苗一、傳統(tǒng)疫苗1.民間：利用天花的干痂來預(yù)防天花。1796年鄉(xiāng)村醫(yī)生EdwardJenner用一種溫和的奶牛的疾病牛痘感染人類，發(fā)現(xiàn)牛痘感染過的人不會再被天花感染。2.第一次獲得了真正意義上的疫苗Jenner把從牛逗膿瘡中得到的滲出液注射到8歲的小男孩JamesPhipps的體內(nèi)，經(jīng)過3次注射后，Phipps對天花有了完全的抗性。第39頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二19世紀末，LouisPasteur制成狂犬病疫苗。VonBehring制成白喉病疫苗。KitasatoShibasaburo制成破傷風(fēng)病疫苗現(xiàn)在人類已經(jīng)獲得了麻疹、白喉、百日咳、破傷風(fēng)、天花、脊髓灰質(zhì)炎等病的疫苗。3.疫苗的發(fā)展但對艾滋病、瘧疾、肺結(jié)核等依然束手無策?？赡苁切枰毎庖撸ㄖ挥袦p毒活疫苗才能有效地誘發(fā)細胞免疫）。第40頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二典型的疫苗主要是滅活的和減毒的致病物質(zhì)。病源物在培養(yǎng)、純化后，或者被滅活，或者被降低毒性，但前提是不能喪失其引起免疫反應(yīng)的能力。4.疫苗的成分5.傳統(tǒng)疫苗的局限性（1）有些致病物無法在培養(yǎng)基上生長，所以很多病沒辦法獲得疫苗。（2）動物和人的病毒需要在動物細胞中培養(yǎng)，成本極高。第41頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二（3）培養(yǎng)的動物或人類病毒的生長速度和產(chǎn)量一般較低。（4）需要對實驗室和實驗人員采取保護措施。（5）疫苗中的致病物質(zhì)在生產(chǎn)中有可能沒有被完全殺死或充分減毒。（6）減毒的菌株有可能發(fā)生突變。（7）有些疾?。ㄈ鏏IDS）用傳統(tǒng)的疫苗防治效果甚微。（8）絕大多數(shù)現(xiàn)行的疫苗的有效期都很短，并需要冷凍保存，不利于在落后地區(qū)推廣。第42頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二二、基因工程疫苗用基因工程的方法表達出病源物的一段基因序列，將表達產(chǎn)物（多數(shù)是無毒性、無感染能力、但有較強的免疫原性）用作疫苗。目前使用的多數(shù)乙肝疫苗就屬于基因工程疫苗。1.亞基疫苗（subunitevaccine）利用病源物的某一部分制得的疫苗稱為亞基疫苗。第43頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二①亞基疫苗非常適合于用基因工程技術(shù)生產(chǎn)。②避免了直接使用病源物帶來的危險。③利用純化的蛋白質(zhì)作免疫源，避免了由于外源蛋白和核酸的混雜造成的副作用。缺點①純化蛋白十分昂貴。②純化后的蛋白的構(gòu)象可能與在體內(nèi)時不同，導(dǎo)致抗原性發(fā)生變化。③亞基疫苗不具備感染性，所以一般不能激活MHCI分子，也就很難激活殺傷性T細胞。（1）亞基疫苗的優(yōu)缺點：優(yōu)點第44頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二（2）亞基疫苗舉例①單純皰疹病毒（HSV）疫苗衣殼呈20面體，周圍有一層無定形的物質(zhì)（殼皮）覆蓋。殼皮外是類脂雙層膜?；蚪M是線性雙鏈DNA，長152.5kb，含有末端重復(fù)序列和內(nèi)部重復(fù)序列。TRL長獨特區(qū)ULIRL

IRS短獨特區(qū)USTRS長基因組區(qū)短基因組區(qū)HSV的核心是纏有DNA的纖絲卷軸，纖維的末端在衣殼下側(cè)固定。第45頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二HSV顆粒中至少有33種蛋白，其中一半是糖蛋白。制備亞基疫苗的基本前提是鑒定出哪些成分能激發(fā)機體產(chǎn)生抗體。HSV-1型的衣殼蛋白D（gpD）就是能引起老鼠產(chǎn)生完整的HSV抗體的成分。gpD是個膜蛋白，把其跨膜區(qū)刪除，成為分泌蛋白，成為疫苗。膜N端（膜外）C端（膜內(nèi)）跨膜區(qū)膜CN改造過的gpD第46頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二②口蹄疫病毒（FMDV）疫苗傳統(tǒng)的口蹄疫疫苗是用甲醛滅活的口蹄疫病毒。FMDV中得到抗體產(chǎn)生的主要成分是病毒衣殼蛋白1（VP1）。（foot-and-mouthdiseasevirus）FMDV是單鏈RNA病毒。對牛和豬有極強的毒性。將VP1的cDNA克隆表達、純化。第47頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二2.肽疫苗衣殼蛋白組成的外殼病毒衣殼病毒核酸動物病毒結(jié)構(gòu)根據(jù)動物病毒的結(jié)構(gòu)，可以推測：只有位于衣殼外表的蛋白結(jié)構(gòu)域才能引起免疫反應(yīng)。因此只需要合成衣殼蛋白的抗原決定簇（小肽）就可以當作疫苗。第48頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二VP1C端的3個肽段（141-160aa、151-160aa、200-213aa）和N端的3個肽段（9-24aa、17-32aa、25-41aa）分別接到載體蛋白上（提高小肽的穩(wěn)定性）。結(jié)果：141-160aa的肽段能誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生足夠的FMDV抗體。如果把141-158aa與200-213aa兩個肽段連起來，不用載體蛋白穩(wěn)定就能激發(fā)豚鼠產(chǎn)生高水平的抗體。比任何一個肽段單獨使用更有效。第49頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二把VP1的142-160aa序列于具有強免疫源性的載體蛋白——乙肝抗原蛋白（HBcAg）連接，會自動組裝成“27nm”顆粒，VP1的小肽恰好位于顆粒外表面。這可能成為未來投送肽疫苗的常規(guī)方法。肽疫苗的局限性：肽段不能太長、肽段的構(gòu)象與抗原決定簇的構(gòu)象要一致、必須有足夠強的免疫源性。第50頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二3.活體重組疫苗用基因工程的方法對細菌和病毒進行改造，使之成為活體重組疫苗（liverecombinantvaccine）組成：可以是非致病的微生物，用基因工程方法使之帶上并表達某種特定病源物的抗原決定簇基因，產(chǎn)生免疫原性。也可以是本來的致病微生物，通過基因改造去掉毒性基因后仍保持免疫原性。第51頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二霍亂活體重組疫苗的制作病原菌：霍亂弧菌（Vibrocholerae）致病物：腸毒素。腸毒素的結(jié)構(gòu)：1個A亞基和5個相同的B亞基。A亞基有ADP糖基化活性，有兩個功能域：A1肽（毒性區(qū)，194aa）、A2肽（連接A1和B亞基）。亞基疫苗對霍亂菌的感染沒有免疫作用。利用重組DNA技術(shù)破壞A1肽的基因序列，使突變的菌株不能產(chǎn)生腸毒素，成為非致病菌，做疫苗。第52頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二第53頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二4.細菌疫苗在非致病菌的細胞表面插入致病菌的表面抗原。在細菌的鞭毛蛋白的高變區(qū)基因中插入霍亂菌素B亞基的50個氨基酸的DNA片斷。然后把重組DNA導(dǎo)入無鞭毛的沙門氏菌株。實驗證明轉(zhuǎn)入后的表達產(chǎn)物既有正常的鞭毛功能，又能激發(fā)小鼠產(chǎn)生高水平的針對霍亂菌素的抗體。第54頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二5.腫瘤疫苗腫瘤疫苗的應(yīng)用基礎(chǔ)是存在腫瘤特異性抗原，同時免疫系統(tǒng)對該抗原能夠產(chǎn)生有效的應(yīng)答。(1)腫瘤細胞疫苗用腫瘤細胞作為抗原而制備的疫苗（必須事先滅活）。（2）基因工程腫瘤疫苗將不同的外源基因?qū)肽[瘤細胞后再制成疫苗。機理不十分清楚、效果很差。仍需努力。第55頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二6.DNA疫苗1993年Wolff等意外地發(fā)現(xiàn)將DNA直接注射到小鼠骨骼肌細胞后可直接引起特異性免疫反應(yīng)，而且可以持續(xù)2個月以上。1994年和1995年WHO和美國科學(xué)院分別召開專題會議討論DNA免疫的應(yīng)用前景。流感病毒的核心蛋白抗原（NP）表達載體小鼠骨骼細胞流感病毒小鼠存活率提高50%！第56頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二（1）DNA疫苗的構(gòu)成DNA疫苗是指含有一種病原體抗原編碼基因的重組質(zhì)粒DNA。①抗原編碼基因?qū)τ诓灰鬃儺惖牟≡哼x用病原體表面糖蛋白編碼基因。對于容易變異的病毒：選擇各型共有的核心蛋白基因中的保守DNA序列。i）選用第57頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二ii）抗原編碼基因的分離和篩選表達文庫免疫技術(shù)（ELI）Expression-libraryimmunization)基本原理：病原體的DNA片段特定的質(zhì)粒病原基因文庫分別進行DNA免疫測試篩選病原基因組中最具有免疫激活反應(yīng)的DNA片段第58頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二②質(zhì)粒表達載體大多數(shù)采用pUC系列的質(zhì)?；竟羌??；窘M成元件：細菌復(fù)制起點（ColEIori）。細菌抗性基因（Ampr、Kanr）。PolyA加尾信號。CpG序列（增強DNA免疫活性）。哺乳動物強啟動子（CMV、SV40）。CMV：cytomegalovirus（巨細胞病毒）。第59頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二（2）DNA疫苗的作用機理與重組亞基疫苗類似，都是利用單一的蛋白質(zhì)抗原分子來誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。（3）DNA疫苗的優(yōu)點①既能誘導(dǎo)體液免疫，又能誘導(dǎo)細胞免疫。②同一個質(zhì)粒上可以容納多個抗原基因，有可能獲得對多種疾病的免疫能力。③DNA比蛋白質(zhì)容易制備和保存。（4）DNA疫苗的缺點①普遍存在免疫效力低的問題。②安全性問題（整合位點、后果）第60頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二（5）DNA疫苗的改進①載體的優(yōu)化增強載體的表達能力：如采用增強子—啟動子復(fù)合物。提高載體的復(fù)制能力：（DNA疫苗不能自我復(fù)制）甲病毒（alphavirus）是個負鏈RNA病毒，編碼復(fù)制酶（具有自我水解功能）?？梢栽诩闹骷毎麅?nèi)獨立復(fù)制。有可能利用該病毒作載體（用外源基因替換其結(jié)構(gòu)基因）。第61頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二用CpG序列優(yōu)化載體：試驗表明適當長度的非甲基化的CpG序列對提高DNA疫苗的免疫原性具有重要的作用。第62頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二第四節(jié)人類疾病的基因治療迄今為止，還沒有遺傳病患者經(jīng)傳統(tǒng)的治療方法治療后能過上正常人的生活，他們的后代也同樣難逃厄運。臨床統(tǒng)計：25%的生理缺陷、30%的兒童死亡、60%的成年人疾病都是由遺傳疾病引起的。第63頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二一、基因治療的回顧和現(xiàn)狀（1）基因治療的概念向靶組織或細胞中引入外源基因DNA或RNA片段，以糾正或補償基因的缺陷，關(guān)閉或抑制異常表達的基因，從而達到治療的目的。（2）基因治療的發(fā)展1973年一名美國醫(yī)生在德國給一對姐妹（缺少一種稀有的酶）注入肖普氏乳頭瘤病毒，結(jié)果無效。第64頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二第二例是在1980年，美國一名醫(yī)生對兩名地中海貧血患者進行基因治療。由于未得到NIH的批準，受到廣泛的抨擊。后來開始在動物身上進行試驗。NIH及其下屬的重組DNA顧問委員會經(jīng)過長期的審查，終于批準了美國第一例臨床治療申請。1990年9月14日正式開始，由Genetictherapy公司和NIH?；颊撸簝晌换紘乐鼐C合性免疫缺損癥（SCID）（缺少腺苷酸脫氨酶（ADA））的姑娘。第65頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二第一位接受基因治療的人AshantiDiSilva第66頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二方案：把克隆的腺苷酸脫氨酶基因轉(zhuǎn)入患者的T淋巴細胞，培養(yǎng)后再轉(zhuǎn)入患者體內(nèi)。療效：AshantiDiSilva的癥狀有所改善，25-30%的T細胞能維持正常的ADA水平，至今生活正常。但與她同時接受治療的另一位女孩失敗了。第67頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二第68頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二1991年Rosenberg等對50名黑色素瘤晚期患者進行基因治療，取得一定的效果。迄今為止，所有的基因治療方法都是針對體細胞的，處于倫理、安全、技術(shù)上的考慮，性細胞基因治療方案尚未被列入研究日程。方案：把外源的腫瘤壞死因子基因轉(zhuǎn)入腫瘤侵潤淋巴細胞（TIL），結(jié)果這種TIL能集中在腫瘤所在的部位殺死腫瘤細胞。第69頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二二、體細胞治療的生物學(xué)問題（1）如何選定并獲得用來進行基因治療的細胞。（2）如何將修正的目的細胞重新引入患者體內(nèi)。（3）如何控制轉(zhuǎn)入的正?；虻谋磉_。（4）轉(zhuǎn)基因細胞能否在體內(nèi)增值。第70頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二三、基因治療的方案1.體外—原位（exvivo)基因治療把病人的體細胞取出，在體外加入正?；蛐Ｕ?，再把校正的細胞放回病人體內(nèi)。已批準了100多個臨床方案。2.體內(nèi)（invivo）基因治療原位：將新基因直接引入病人的疾病部位（病毒載體或DNA)。通過血液把治療性基因帶到病組織。第71頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二引入目的基因的mRNA的反義序列，與目的基因的mRNA相配對，造成供翻譯的mRNA大量減少，制止病基因的表達。也可以引入目的基因的反義DNA。3.反義（antisense）基因治療。第72頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二第73頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二反義RNA的作用反義寡聚RNA與mRNA形成雙鏈后，誘使RNaseH把mRNA切斷第74頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二核酶是一類具有催化活性的RNA分子。參與細胞內(nèi)多種RNA及其前體的加工和成熟過程。4.核酶（ribozyme）基因治療。發(fā)現(xiàn)者Altman和Cech獲1989年諾貝爾化學(xué)獎。第75頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二1988年，Haseloff和Cerlsch根據(jù)核酶RNA的錘頭結(jié)構(gòu)設(shè)計出第一個具有特異切割活性的人造核酶，并在體證實它確實具有特異性的切割活性。其中利用核酶抗HIV感染的工作尤其受到重視。細胞實驗表明，核酶確實具有切割HIV基因組并阻斷其復(fù)制的效果。第76頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二四、基因治療用的載體1.反轉(zhuǎn)錄病毒載體主要是病毒。反轉(zhuǎn)錄病毒（ritrovirus）屬于正鏈RNA病毒，顯著的特點是具有2倍體基因組。兩個相同的RNA分子在5’端附近經(jīng)氫鍵連接形成70SRNA，這種結(jié)構(gòu)可能在逆轉(zhuǎn)錄過程中起調(diào)節(jié)作用?；蚪M結(jié)構(gòu)：類似于真核細胞mRNA反轉(zhuǎn)錄病毒一般只感染處在分裂狀態(tài)的細胞。第77頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)第78頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二流感病毒第79頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二HIV第80頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二如Moloneymurineleukemiavirus(MoloneyMLV)envpolgagU3U3U5U5cappolyA3’5’LTRLTRU5、U3：5’段或3’端獨特序列。LTR：長末端重復(fù)序列。在病毒基因組整合中至關(guān)重要。整合時，整合酶在U5-U3連接處切開雙鏈DNA，隨機插入到宿主基因組里。LTR本身還具有啟動子和polyA加尾信號的功能。RR+第81頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二+：組裝時必需的非編碼序列。env：外殼蛋白。pol：反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶。gag：核心蛋白。第82頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二（1）反轉(zhuǎn)錄病毒載體的優(yōu)點①能穩(wěn)定地將DNA插入宿主基因組的隨機位點上。②侵染范圍廣、感染率高。③整合的原病毒在宿主基因中比較穩(wěn)定，拷貝數(shù)目較低。④包裝的外源DNA可達10kb。⑤反轉(zhuǎn)錄病毒感染哺乳動物細胞，對宿主細胞沒有毒性。第83頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二（2）用于基因治療的反轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建①把反轉(zhuǎn)錄病毒基因組中的整個pol、env和gag基因的3’端刪除。②插入標記基因（如neor）。③外源基因和啟動子插入到+下游。5’LTR+外源基因neor3’LTR第84頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二反轉(zhuǎn)錄病毒DNA轉(zhuǎn)化細胞的效率很低，必須包裝成病毒顆粒轉(zhuǎn)染細胞。用兩個缺失了+的反轉(zhuǎn)錄病毒染色體轉(zhuǎn)化細胞，以制造病毒外殼蛋白。（3）包裝細胞系的構(gòu)建第85頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二5’LTRgag3’LTRpolenv3’LTR5’LTR病毒外殼蛋白包裝細胞第86頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二（4）載體RNA的包裝①用載體DNA轉(zhuǎn)化包裝細胞系轉(zhuǎn)入的載體上帶有+，轉(zhuǎn)錄成的載體RNA就會被包裝細胞中原有的病毒外殼蛋白識別包裝成重組病毒顆粒。5’LTR+外源基因neor3’LTR（5）利用這種重組病毒顆粒，高效轉(zhuǎn)染靶細胞進行基因治療。第87頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二2.腺病毒（adenovirus）載體（1）腺病毒的基因組：（2）腺病毒的優(yōu)點：①比較安全，無致病、致癌、致畸作用。②宿主范圍廣，不僅能感染有分裂能力的細胞，也能感染不能分裂的細胞（如神經(jīng)細胞）。線狀雙鏈DNA病毒，基因組中有14個基因。共同特點是都帶有倒置的末端重復(fù)（ITR），在病毒的復(fù)制過程中起非常重要的作用。第88頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二腺病毒的結(jié)構(gòu)第89頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二③可以在呼吸道和腸道中繁殖，可以通過口服或噴霧的方式進行基因治療。④載體中的插入片段可達7.5kb（有包裝容量限制）。⑤腺病毒容易制備、純化。⑥基因組結(jié)構(gòu)和功能了解得清楚。是目前最常用的基因治療載體之一。第90頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二①把腺病毒DNA刪除一些非必須區(qū)（如E1或E3區(qū)），增加插入能力。②構(gòu)建質(zhì)粒，含有E1或E3區(qū)兩側(cè)的同源序列。兩側(cè)序列之間插入外源基因和選擇標記基因。（3）腺病毒載體的構(gòu)建用同源重組的方法插入外源基因。ITRE1ITRE3第91頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二③把質(zhì)粒切成線性。④質(zhì)粒與病毒DNA（缺失E1或E3）共同轉(zhuǎn)染細胞，在細胞中發(fā)生同源重組，把外源DNA加到病毒基因組中。⑤分離重組腺病毒，成為基因治療的載體。第92頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二（4）重組腺病毒DNA在細胞中的生存①以游離的附加體形式存在于細胞中，不能整合到細胞基因組中?；虮磉_時間短。②E1是腺病毒繁殖的必須區(qū)。缺失E1的重組腺病毒必須在已經(jīng)被腺病毒（輔助病毒）感染的細胞中繁殖。③E3區(qū)在腺病毒的繁殖過程中不是必需的。缺失E3的重組腺病毒不需要輔助病毒。第93頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二第94頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二第95頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二五、癌癥的基因治療國際上已批準的130多種基因治療方案中，70%是針對癌癥的。（1）癌癥的基因治療中常用的治療性基因①直接殺傷或抑制癌細胞生長的基因：抑癌基因、癌基因的反義序列、編碼細胞程序性死亡的基因等。②可提高免疫系統(tǒng)能力的基因：細胞因子基因等。第96頁，共111頁，2023年，2月20日，星期二（2）導(dǎo)入抑癌基因的基因治療③多種藥物的耐藥性基因：主要目的是提高造血細胞及其他細胞對放療、化療及其他