細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)

細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)第1頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)顯微技術(shù)細(xì)胞生物學(xué)的建立和發(fā)展得益于光學(xué)顯微鏡的發(fā)明；電子顯微鏡的發(fā)明使對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的研究達(dá)到了新的水平。第2頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡的主要差別在所使用的光源不同，但分辨率卻相差非常大：光學(xué)顯微鏡的最大分辨率：0.2μm電子顯微鏡的分辨率：0.2nm第3頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二一、顯微鏡的成像原理所有類型的顯微鏡，鏡像的形成都需要3個(gè)基本要素：

1、照明系統(tǒng)；

2、被觀察的物品；

3、聚焦成像的透鏡系統(tǒng)第4頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二照明系統(tǒng)的波長(zhǎng)是顯微鏡成像的重要因素，因?yàn)椴ㄩL(zhǎng)能決定被檢測(cè)物體的最小極限，波長(zhǎng)越長(zhǎng)，波幅的跨度就越大，所能觀察到物體的極限就越大。第5頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1、分辨率（Resolution）是指能分辨出相鄰兩個(gè)物點(diǎn)間的最小距離的能力。一般規(guī)定：顯微鏡或人眼在25cm明視距離處，能清楚分辨被檢物體細(xì)微結(jié)構(gòu)最小間隔的能力，稱分辨率。第6頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二分辨力可用公式計(jì)算：R=0.61λ/N.A.

N.A.＝ｎsinα式中：λ=波長(zhǎng)；n=介質(zhì)折射率；α=鏡口角（標(biāo)本對(duì)物鏡鏡口張角的1/2），N.A.=鏡口率（numericaperture）。鏡口角總是要小于90?，sinα的最大值小于1。第7頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第8頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二不同光源的波長(zhǎng)名稱可見(jiàn)光紫外光X射線α射線電子束0.1Kv10Kv波長(zhǎng)(nm)450-76013~3900.05~130.005~10.1230.0122第9頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2、最大分辨率R值越小，分辨率越高，即需要λ盡可能地小，和N.A.盡可能大?？梢?jiàn)光中以藍(lán)光波長(zhǎng)最短，λ=450nm；目前最好的玻璃透鏡的α=70?，sinα=0.94;空氣的折射率n≈1；所以光鏡的最大分辨率：R=450/1*0.94=292nm=0.3μm第10頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二3、分辨極限與放大率顯微鏡的最大分辨率即是它的分辨極限。最終成像的大小與原物體大小的比值稱為放大率（magnification）?？偡糯舐?物鏡的放大率*目鏡放大率放大率受分辨極限的限制。一般，光學(xué)顯微鏡的最大放大率只能是數(shù)值孔鏡（N.A.）的1000倍。第11頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二二、光學(xué)顯微鏡（一）、普通雙目顯微鏡*照明系統(tǒng)：可見(jiàn)光源*光學(xué)放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，都是由玻璃透鏡組構(gòu)成；在物鏡上方裝有4個(gè)棱鏡，使物鏡的光線平分為兩路到達(dá)目鏡*機(jī)械和支架系統(tǒng)：保證光學(xué)系統(tǒng)的準(zhǔn)確配制和靈活調(diào)控

第12頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1.TheLightMicroscopy（LM）第13頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二光鏡觀察樣本的制備取材－固定－脫水－包埋－切片－脫蠟－復(fù)水－染色－脫水－透明－封片－觀察

石蠟切片.第14頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2、倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣，只不過(guò)物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，普通顯微鏡在載物臺(tái)之下，倒置顯微鏡在載物臺(tái)之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，具有相差物鏡。第15頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第16頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二3、暗視野顯微鏡

（darkfieldmicroscope）聚光鏡中央有擋光片，使照明光線不直接進(jìn)入物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。能觀察4~200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。第17頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第18頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二4、熒光顯微鏡是對(duì)能發(fā)熒光的物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具。細(xì)胞中有些物質(zhì)如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；有些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但用熒光染料染色，紫外線照射也發(fā)熒光。

第19頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第20頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熒光顯微鏡和普通顯微鏡區(qū)別：1、照明方式通常為落射式，即光源通過(guò)物鏡投射于樣品上；2、光源為紫外光，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡；3、有兩個(gè)特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見(jiàn)光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護(hù)人目。第21頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第22頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第23頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二5、激光共聚焦掃描顯微境

（laserconfocalscanningmicroscope）*用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面掃描成像，激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。*調(diào)焦一次，掃描限制在樣品一個(gè)平面。調(diào)焦深度不一時(shí)，可獲樣品不同層次圖像，經(jīng)計(jì)算機(jī)模擬，能顯示樣品的立體結(jié)構(gòu)。*激光波長(zhǎng)短，光束細(xì)，分辨率是光鏡的3倍。第24頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第25頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第26頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第27頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Comparisonofconventionalandconfocalfluorescencemicroscopy.Thesetwomicrographsareofthesameintactgastrula-stageDrosophilaembryothathasbeenstainedwithafluorescentprobeforactinfilaments.Theconventional,unprocessedimage(A)isblurredbythepresenceoffluorescentstructuresaboveandbelowtheplaneoffocus.Intheconfocalimage(B),thisout-of-focusinformationisremoved,whichresultsinacrispopticalsectionofthecellintheembryo.

第28頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二6、相差顯微鏡

（phase-contrastmicroscope）由Zernike于1932年發(fā)明，并因此獲1953年諾貝爾物理獎(jiǎng)。最大的特點(diǎn)是可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。第29頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二基本原理：把透過(guò)標(biāo)本的可見(jiàn)光的光程差變成振幅差（明暗差），從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使結(jié)構(gòu)變得清晰可見(jiàn)。光線透過(guò)標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來(lái)的光路，同時(shí)被延遲了1/4λ，如再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強(qiáng)，振幅增大或減小，提高反差。第30頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二構(gòu)造上，相差顯微鏡不同于光鏡之處：1、環(huán)形光闌（annular

diaphragm）位于光源與聚光器之間，使透過(guò)聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標(biāo)本上。2、相位板（annularphaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。第31頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第32頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Figure3-2.Interferencebetweenlightwaves.Whentwolightwavescombineinphase,theamplitudeoftheresultantwaveislargerandthebrightnessisincreased.Twolightwavesthatareoutofphasepartiallycanceleachotherandproduceawavewhoseamplitude,andthereforebrightness,isdecreased.第33頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第34頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二7、微分干涉顯微鏡

（differential-interferencemicroscope）

1952年，Nomarski在相差顯微鏡原理的基礎(chǔ)上發(fā)明。優(yōu)點(diǎn)是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，標(biāo)本可略厚，折射率差別更大，故影像立體感更強(qiáng)。第35頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二圖2-10DIC顯微鏡下的硅藻（偽彩色）第36頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二DIC顯微鏡使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，特別是一些較大的細(xì)胞器，如核、線粒體等，立體感特別強(qiáng)，適合于顯微操作。目前像基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進(jìn)行。第37頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二四種類型顯微鏡對(duì)成纖維細(xì)胞觀察效果的比較：(A)明視野顯微鏡；(B)相差顯微鏡；(C)微分干涉顯微鏡；(D)暗視野顯微鏡第38頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二二、電子顯微鏡

光學(xué)顯微鏡受照射光波長(zhǎng)的限制，在可見(jiàn)光下其分辨極限只有0.2μm，即使在紫外光下，最大分辨率也只有0.1μm，要觀察更精細(xì)的結(jié)構(gòu)，只有借助分辨率更高的電子顯微鏡。第39頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（一）透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope，TEM)Ruska1932年發(fā)明。以電子束為光源，波長(zhǎng)比可見(jiàn)光和紫外光短得多，且電子束的波長(zhǎng)與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比。最大分辨率達(dá)0.2nm。第40頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第41頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1、透射電鏡的結(jié)構(gòu)由5部分組成：1、電子照明系統(tǒng)：電子槍；2、真空系統(tǒng)：用真空泵和油擴(kuò)散泵獲得高真空；3、電磁透鏡成像系統(tǒng)：規(guī)范電子的行為；4、記錄系統(tǒng)：用熒光屏觀察影像，用照相系統(tǒng)記錄影象；5、電源系統(tǒng)：提供高壓穩(wěn)壓。第42頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第43頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2、電鏡制樣技術(shù)第44頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（1）超微切片技術(shù)石蠟切片:3-10um;超薄切片:40-50nmSectionsofLM:>5um;SectionsofTEM:<100nm

第45頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二由于電子束的穿透力很弱，因此用于電鏡的標(biāo)本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。這種切片需要用超薄切片機(jī)（ultramicrotome）制作。第46頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第47頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Thinsectionscoppergridusedtosupportthethinsectionsofaspecimeninthetransmissionelectronmicroscope.第48頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

SpecimenPreparationforElectronMicroscopy

Twocommonchemicalfixativesusedforelectronmicroscopy.Thetworeactivealdehydegroupsofglutaraldehydeenableittocross-linkvarioustypesofmolecules,formingcovalentbondsbetweenthem.Osmiumtetroxideisreducedbymanyorganiccompoundswithwhichitformscross-linkedcomplexes.Itisespeciallyusefulforfixingcellmembranes,sinceitreactswiththeC=Cdoublebondspresentinmanyfattyacids.第49頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Electronmicrographofaroot-tipcellstainedwithosmiumandotherheavymetalions.

Thecellwall,nucleus,vacuoles,mitochondria,endoplasmicreticulum,Golgiapparatus,andribosomesareeasilyseen.第50頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二通過(guò)連續(xù)切片達(dá)到被檢樣品的三維結(jié)構(gòu)的重構(gòu)

第51頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（2）負(fù)染色技術(shù)負(fù)染是用重金屬鹽（磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色；

吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽，而凸的出地方則沒(méi)有染料沉積，呈負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm。第52頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二經(jīng)負(fù)染的肌動(dòng)蛋白纖維第53頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二(3)冰凍蝕刻(freeze-etching)

樣本置-196?C液氮中冰凍。然后用冷刀驟然將標(biāo)本斷開(kāi)，冰在真空下迅速升華，暴露出斷面結(jié)構(gòu)，稱蝕刻。蝕刻后，向斷面噴涂一層鉑和碳，加強(qiáng)反差和強(qiáng)度。再用次氯酸鈉溶液消化樣品，剝下碳和鉑的膜，即復(fù)膜。復(fù)膜代表標(biāo)本蝕刻面的形態(tài)，電鏡下的影像即代表標(biāo)本斷面的結(jié)構(gòu)。第54頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第55頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第56頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第57頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（二）掃描電鏡

（Scanningelectronmicroscope(SEM)

*問(wèn)世于20世紀(jì)60年代；*用來(lái)觀察標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。*掃描電鏡的分辨力為6~10nm，最大有效放大倍率為20000X。

第58頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第59頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二工作原理*用細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)。*次級(jí)電子由探測(cè)器收集，轉(zhuǎn)為光信號(hào)，再經(jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)為電信號(hào)來(lái)控制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示掃描圖像。圖像為立體，顯示標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。第60頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第61頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。第62頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第63頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)中的小鼠成纖維細(xì)胞掃描照片第64頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第65頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二三、掃描隧道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope,STM)

Binnig等1981年發(fā)明，根據(jù)量子力學(xué)原理中的隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)。

Binnig等因此獲得1986年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。第66頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（一）工作原理當(dāng)原子尺度的針尖在不到一納米的高度掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加2mV~2V電壓，針尖與樣品之間產(chǎn)生隧道效應(yīng)而有電子逸出，形成隧道電流。電流強(qiáng)度和針尖與樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系。樣品表面原子凹凸不平，使探針與物質(zhì)表面間的距離不斷改變，致電流改變。將改變的電流圖像化即可顯示出原子水平的形態(tài)。

第67頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（二）主要特點(diǎn)1、分辨率高，橫向?yàn)?.1~0.2nm，縱向可達(dá)0.001nm；2、可在固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)下進(jìn)行觀察；3、非破壞性觀察。第68頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二四、原子力顯微鏡

(atomicforcemicroscope,AFM)*Binning在STM基礎(chǔ)上發(fā)明。*特點(diǎn)：不要求樣品是導(dǎo)電體。*原理：針尖安裝在靈敏的懸臂上，當(dāng)針尖原子與樣品表面原子間的原子力變化時(shí)，懸臂發(fā)生偏移，通過(guò)激光可測(cè)出，并掃描出原子水平的結(jié)構(gòu)圖像。第69頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)細(xì)胞分離技術(shù)第70頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二一、離心技術(shù)離心是研究各種細(xì)胞器和大分子基本手段。高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速為10~25Kr/min；超速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速超過(guò)25Kr/min，離心力大于89Kｇ。第71頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二(一)差速離心

(differentialcentrifugation)

*在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級(jí)離心，分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。*差速離心中細(xì)胞器沉降的順序：核、線粒體、溶酶體與過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、核糖體。

第72頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀第73頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二(二)密度梯度離心

(densitygradientcentrifugation)

1、速度沉降:用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。2、等密度沉降:適用于分離密度不等的顆粒。第74頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第75頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二二、細(xì)胞電泳(cellelectrophoresis)*一定pH下，細(xì)胞表面帶正或負(fù)電，可在外加電場(chǎng)下發(fā)生泳動(dòng)。*各種細(xì)胞帶電量不同(ξ電位)，在一定電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度不同。通過(guò)測(cè)定電泳速度可推算出細(xì)胞的ξ電位。*ξ電位常因細(xì)胞生理和病理狀態(tài)而異，在診斷疾病上有一定價(jià)值。第76頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第三節(jié)細(xì)胞組分分析方法揭示細(xì)胞內(nèi)生物大分子物質(zhì)的功能及其相互間的關(guān)系。第77頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二一、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

利用染色劑可同細(xì)胞的某種成分發(fā)生反應(yīng)而著色的原理，對(duì)某種成分進(jìn)行定性或定位研究。能顯示蛋白質(zhì)、核酸、酶、糖類、脂類、無(wú)機(jī)物等。第78頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1、Schiff反應(yīng)(Feulgen反應(yīng))

細(xì)胞中的醛基可使Schiff試劑中的無(wú)色品紅變?yōu)榧t色。常用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應(yīng)）。第79頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2、金屬沉淀法利用金屬化合物在反應(yīng)過(guò)程中生成有色沉淀，借以辨認(rèn)所檢查的物質(zhì)或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。第80頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Electronmicrographofacellshowingthelocationofaparticularenzyme(nucleotidediphosphatase)intheGolgiapparatus.Athinsectionofthecellwasincubatedwithasubstratethatformedanelectron-denseprecipitateuponreactionwiththeenzyme第81頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二3、脂染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。4、茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)。5、聯(lián)苯胺反應(yīng)：過(guò)氧化物酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者再將無(wú)色的聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，變成棕色化合物。第82頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二二、免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry）

*根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同抗原特異性結(jié)合，對(duì)抗原進(jìn)行定位。*將抗體結(jié)合上標(biāo)記物，再與組織中的抗原反應(yīng)，可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于細(xì)胞或組織中的部位。

第83頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1、免疫熒光法(immunofluorescenttechnique)

采用熒光素（異硫氰酸酯、羅丹明）標(biāo)記。將熒光色素同抗原或抗體結(jié)合，然后使其與組織切片或細(xì)胞涂片標(biāo)本中各個(gè)相對(duì)應(yīng)的抗體或抗原結(jié)合，用熒光顯微鏡檢查其定位的方法免疫熒光法有直接法和間接法（sa-ndwich法）。直接法依靠熒光抗體與抗原或熒光抗原同抗體的結(jié)合；與此相反，間接法首先使抗原（抗體）結(jié)合相對(duì)應(yīng)的抗體（抗原），然后讓那種抗體（抗原）與相對(duì)應(yīng)的熒光抗原（抗體）結(jié)合。第84頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2、酶標(biāo)免疫法(enzyme-labeledantibodymethod)

采用酶（辣根過(guò)氧化物酶）標(biāo)記，酶與底物反應(yīng)后形成不透明的沉積物，顯示出抗原存在的部位。3、免疫電鏡技術(shù)：用重金屬標(biāo)記，如膠體金第85頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二免疫電鏡照片：抗體用膠體金顆粒標(biāo)記.顯示胰島素分泌細(xì)胞中胰島素的存在部位和方式。第86頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二三、放射自顯影術(shù)(radioautography)*用于研究被標(biāo)記化合物在組織和細(xì)胞中的分布及動(dòng)態(tài)。*原理：將放射性同位素(14C和3H)標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，將標(biāo)本制成切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。經(jīng)顯影顯示黑色銀顆粒，即可知標(biāo)本中標(biāo)記物的位置和數(shù)量。*這種技術(shù)與電鏡結(jié)合，則為電鏡放射自顯影術(shù)。第87頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第88頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二電鏡放射自顯影照片：胰腺細(xì)胞飼喂含3H的亮氨酸5分鐘，這種氨基酸大部分都被合成胰島素。黑色銀顆粒顯示，胰島素最初出現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，10分鐘后被運(yùn)到高爾基體(A),45分鐘后它出現(xiàn)在分泌小泡中。(B).第89頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二四、分子雜交技術(shù)

(molecularhybridization)*是在DNA分子變性和復(fù)性基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種技術(shù)。*原理：具互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子，適宜條件下，可結(jié)合形成DNA-DNA，DNA-RNA或

RNA-RNA雜交的雙鏈分子。*可測(cè)定單鏈核苷酸間序列有否互補(bǔ)。第90頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二(一)原位雜交(insituhybridization)用來(lái)檢測(cè)染色體上的特殊DNA序列。1、帶放射性DNA探針；2、免疫探針?lè)ǖ?1頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第92頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（二）Southern雜交*是體外分析特異DNA序列的方法。*先用限制性內(nèi)切酶將DNA切成片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用標(biāo)記的探針雜交，辨認(rèn)出與探針互補(bǔ)的特殊核苷序列。

第93頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第94頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二五、定量細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（一）顯微分光光度測(cè)定技術(shù)

細(xì)胞中有些成分具特定的吸收光譜，如核酸的吸收波長(zhǎng)為260nm，蛋白質(zhì)為280nm。根據(jù)細(xì)胞成分的這種特性，可用顯微分光光度計(jì)對(duì)某些成分進(jìn)行定量測(cè)定。

第95頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（二）流式細(xì)胞術(shù)

（flowcytometery）*對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分選與定量分析。*原理：對(duì)待測(cè)成分染色或抗體標(biāo)記，用鞘液的液滴包裹單個(gè)細(xì)胞，在激光束照射下，細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測(cè)器檢測(cè)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，依據(jù)電信號(hào)進(jìn)行分選。*所用儀器為流式細(xì)胞儀。分離純度達(dá)99%。

第96頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第97頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第四節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程

與顯微操作技術(shù)

第98頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二一、細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）

*高等生物由多細(xì)胞構(gòu)成，整體條件下要研究單個(gè)細(xì)胞或某群細(xì)胞在體內(nèi)的活動(dòng)、功能很困難。把活細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)觀察研究，方便得多。*細(xì)胞培養(yǎng)就是選用最佳生存條件對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。

第99頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

1、群體培養(yǎng)(massculture):將含一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，匯合后形成均勻的單細(xì)胞層；2、克隆培養(yǎng)(clonalculture)，將高度稀釋的細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個(gè)細(xì)胞貼壁后，經(jīng)生長(zhǎng)增殖每個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞群落，稱為克?。╟lone）。第100頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）

第101頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二原代培養(yǎng)（primaryculture）：從動(dòng)物機(jī)體取出的進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞群。原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)較緩慢，且繁殖一定代數(shù)后(一般10代)停止生長(zhǎng)，需更換培養(yǎng)基。傳代培養(yǎng)（Passage）：將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)培養(yǎng)瓶。

第102頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)

1、組織培養(yǎng)：誘發(fā)愈傷組織，培養(yǎng)再生植株。2、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)：愈傷組織培養(yǎng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)。制取植物代謝產(chǎn)物。

3、原生質(zhì)體培養(yǎng)：誘導(dǎo)分化成植株；易進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化；進(jìn)行細(xì)胞融合；

4、單倍體培養(yǎng)：花藥或花粉培養(yǎng)獲得單倍體植株，人工加倍后可得純合個(gè)體。

第103頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第104頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二二、細(xì)胞工程(cellengineering)按照人類的需要或愿望，采用工程學(xué)手段，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳改造的技術(shù)。第105頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（一）細(xì)胞融合（cellfusion）

*通過(guò)培養(yǎng)和誘導(dǎo)，兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的過(guò)程。*同種細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)靠在一起的2個(gè)細(xì)胞自發(fā)合并，稱自發(fā)融合；異種細(xì)胞間須經(jīng)誘導(dǎo)才能融合，稱誘發(fā)融合