蛋白質(zhì)溶液的濃縮方法

蛋白質(zhì)溶液的濃縮方法第1頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二目錄1蛋白質(zhì)種類和特性2蛋白質(zhì)濃縮3常用濃縮方法4小結(jié)與展望第2頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二蛋白質(zhì)的種類第3頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二蛋白質(zhì)的性質(zhì)膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的分子量在1萬-100萬之間，直徑在1-100nm之間，屬于膠體粒子。蛋白質(zhì)的水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體，這是因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)顆粒表面帶有很多極性基團(tuán)，如NH3、COO-、OH-、SH、CONH2等和水有高度親和性，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與水相遇時(shí)，就很容易在蛋白質(zhì)顆粒外面形成—層水膜。兩性解離和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)同氨基酸一樣也是兩性電解質(zhì)，在一定的pH條件下，能解離為帶電基團(tuán)從而使蛋白質(zhì)帶電。蛋白質(zhì)的變性第4頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二蛋白質(zhì)溶液的濃縮方法蛋白質(zhì)溶液的濃縮連接了蛋白質(zhì)的提取和蛋白質(zhì)的分離純化，是獲取高濃度或高活性蛋白質(zhì)的重要步驟。濃縮目的：提高蛋白質(zhì)濃度；減少樣品體積；便于進(jìn)一步純化。常用的濃縮方法：沉淀法（蛋白質(zhì)的沉淀性質(zhì)）吸附法（吸水劑）凍干法（真空低溫脫水）超濾法（分子量）第5頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二1.1鹽析法1.2低溫有機(jī)溶劑沉淀法1.3等電點(diǎn)沉淀法1.4

生成鹽復(fù)合物沉淀法1.沉淀法1.5選擇變性沉淀法1.6非離子多聚物沉淀法第6頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二1.沉淀法沉淀法濃縮蛋白質(zhì)溶液，指將蛋白質(zhì)分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象。沉淀法是比較傳統(tǒng)的分離純化蛋白質(zhì)的方法，目前仍然廣泛使用。一般常用的沉淀濃縮有硫酸銨沉淀法、（低溫）有機(jī)溶劑沉淀法、丙酮沉淀法、免疫沉淀法、三氯醋酸沉淀法、聚乙二醇沉淀法等。第7頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二1.1鹽析法定義：鹽析一般指溶液中加入無機(jī)鹽而使某種蛋白質(zhì)溶解度降低而析出的過程。原理：高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可與蛋白質(zhì)競爭水分子，使溶液中自由水分子數(shù)減小，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來。第8頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二1.1鹽析法鹽類的選擇：價(jià)格低； 溶解度好； 溶解過程中產(chǎn)熱少； 鹽溶液密度與沉淀的密度有明顯差別。

一般來說：高價(jià)陰離子：PO43->SO42->Ac-和NO3-， 單價(jià)陽離子：NH4+>K+和Na+， 高價(jià)陰離子的沉淀效果優(yōu)于單價(jià)陽離子。第9頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二1.1鹽析法e.g硫酸銨鹽析法濃縮蛋白質(zhì)溶液 硫酸銨因其價(jià)格便宜、溶解度高且對溫度的敏感性低而被常用于沉淀蛋白質(zhì)。

操作方法：（1）加入固體硫酸銨，適用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況； （2）加入飽和硫酸銨溶液，適用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況； （3）透析平衡法（多用于結(jié)晶），先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進(jìn)行透析，透析袋內(nèi)硫酸銨飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后目的蛋白析出。第10頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二1.1鹽析法硫酸銨鹽析法的注意事項(xiàng)： （1）由于蛋白質(zhì)沉淀的密度與硫酸銨飽和溶液的密度相近，因此離心分離沉淀物時(shí)一般需要高速離心機(jī)。 （2）硫酸銨會(huì)使溶液略微酸化，可用氨水進(jìn)行調(diào)節(jié)。 （3）注意飽和度表中規(guī)定的溫度，加入固體硫酸銨鹽后的體積變化已考慮在表中； （4）鹽析后一般放置半小時(shí)至一小時(shí)，待沉淀完全后才過濾或離心。離心多用于低濃度硫酸銨溶液，而過濾多用于高濃度硫酸銨溶液； （5）硫酸銨中可能含有少量的重金屬離子，使用前必須用H2S處理。第11頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二1.2低溫有機(jī)溶劑沉淀法原理： （1）甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑加入水中使溶劑介電常數(shù)降低，增加了相反電荷的吸引力； （2）上述有機(jī)溶劑是強(qiáng)親水試劑，破壞蛋白質(zhì)膠體分子表面的水化層而使分子聚集沉淀。有機(jī)溶劑的選擇：

有機(jī)溶劑首選能與水混容的，常用乙醇、甲醇、丙酮等。大多數(shù)蛋白質(zhì)通過加入等體積的丙酮或四倍體積的乙醇就可以沉淀下來，但也造成的了蛋白質(zhì)溶液的稀釋，所以蛋白質(zhì)溶液的濃度一般要在1mg/ml以上。

第12頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二1.2低溫有機(jī)溶劑沉淀法影響因素：（1）溫度：低溫可保持生物大分子活性，同時(shí)降低其溶解度，提高提取效率； （2）樣品濃度和pH：與鹽析法中的作用基本相同； （3）金屬離子：一些多價(jià)陽離子如Zn2+和Ca2+在一定pH下能與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，這種復(fù)合物在水中或有機(jī)溶劑中的溶解度都大大下降，而且不影響蛋白質(zhì)的生物活性。 （4）離子強(qiáng)度：鹽濃度太高或太低都對分離有不利影響，對蛋白質(zhì)和多糖而言，鹽濃度不超過5%比較合適，使用的乙醇量不宜超過二倍體積。第13頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二1.2低溫有機(jī)溶劑沉淀法優(yōu)缺點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)：（1）分辨力高于鹽析法，即蛋白質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀； （2）沉淀不用脫鹽，過濾更為容易。

缺點(diǎn)：容易使蛋白質(zhì)變性失活，操作要求在低溫下進(jìn)行。如利用丙酮沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，必須在0~4℃低溫下進(jìn)行。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離，否則蛋白質(zhì)會(huì)變性。第14頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二1.3等電點(diǎn)沉淀法原理：兩性電解質(zhì)分子上的凈電荷為零時(shí)溶解度最低。適用范圍：只適用于水化程度不大、在等電點(diǎn)時(shí)溶解度很低的蛋白質(zhì)，如酪蛋白。對于親水性很強(qiáng)的蛋白質(zhì)，在等電點(diǎn)附近仍然有很大的溶解度，用等電點(diǎn)法沉淀不完全。 等電點(diǎn)法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀方法聯(lián)合使用，以提高其沉淀能力。優(yōu)缺點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)：很多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在偏酸性范圍內(nèi)，調(diào)節(jié)pH時(shí)所需要的無機(jī)酸價(jià)格低，操作也比較方便。 缺點(diǎn)：對低pH敏感的蛋白應(yīng)避免使用此法。第15頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二1.4生成鹽復(fù)合物沉淀法蛋白質(zhì)可生成鹽類復(fù)合物沉淀，主要方法： （l）與酸性功能團(tuán)作用的金屬復(fù)合鹽法（如銅鹽、銀鹽、鋅鹽、鉛鹽、鋰鹽、鈣鹽等），沉淀可通以H2S使金屬變成硫化物而除去； （2）與堿性功能團(tuán)作用的有機(jī)復(fù)合鹽法（如苦味酸鹽、苦酮酸鹽、丹寧酸鹽等），沉淀加入無機(jī)酸并用乙酸萃取，或用離子交換法除去。 （3）無機(jī)復(fù)合鹽法（如磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等）。

但值得注意的是，重金屬、某些有機(jī)酸與無機(jī)酸和蛋白質(zhì)形成復(fù)合鹽后，常使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的沉淀，應(yīng)用時(shí)必須謹(jǐn)慎。第16頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二1.5選擇變性沉淀法原理：利用蛋白質(zhì)對某些物理或化學(xué)因素的敏感性不同，有選擇地使之變性沉淀，以達(dá)到分離提純的目的。方法： （1）利用表面活性劑（三氯乙酸）或有機(jī)溶劑； （2）利用生物大分子的熱不穩(wěn)定性，加熱破壞某些組分，而保存另一些組分； （3）酸堿變性沉淀。很多蛋白質(zhì)在pH5.0或以下被沉淀，只有少數(shù)蛋白質(zhì)在中性或堿性條件下形成沉淀，且可以通過調(diào)節(jié)pH來去除雜蛋白。第17頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二1.6非離子多聚物沉淀法背景：非離子多聚物是六十年代發(fā)展起來的一類重要沉淀劑，最早用于提純免疫球蛋白、沉淀一些細(xì)菌和病毒，近年來逐漸廣泛應(yīng)用于核酸和酶的分離提純。 包括不同分子量的PEG（常用PEG-6000）、NPEO、葡聚糖、右旋糖酐硫酸鈉等。方法：（1）基于不同蛋白質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)不同，分配系數(shù)不同，可選用兩種水溶性非離子多聚物組成液/液兩相體系，不等量分配而分離沉淀。 （2）選用一種水溶性非離子多聚物，使蛋白質(zhì)在同一液相中，由于分子相互排斥而凝聚導(dǎo)致蛋白析出。該方法操作時(shí)先離心除去大懸浮顆粒，調(diào)整溶液PH值和溫度至適度，然后加入中性鹽和多聚物至一定濃度，冷貯一段時(shí)間，即形成沉淀。第18頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二2.1透析袋吸附法2.2凝膠吸附法2.吸附法第19頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二吸附法定義：通過吸附劑直接去除溶液中的水分子以達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。 吸附法是最簡單快速的濃縮蛋白質(zhì)溶液的方法，所需儀器簡單，特別適用于穩(wěn)定性較差的蛋白質(zhì)。吸附劑的選擇：（1）吸附劑不能與溶液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；（2）吸附劑對蛋白質(zhì)不吸附；（3）吸附劑易于溶液分開。常用的吸附劑：PEG、聚乙烯吡咯酮、蔗糖、凝膠等。常用的吸附方法：透析袋法和凝膠濃縮法。第20頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二2.1透析袋吸附法透析袋吸附法在透析技術(shù)的基礎(chǔ)上改良而來的。

傳統(tǒng)的透析是基于分子質(zhì)量大小的液相分離技術(shù)，它由透過半透膜的選擇性擴(kuò)散來實(shí)現(xiàn)。但是純粹的透析主要用于除去小分子類的溶質(zhì)，而要達(dá)到濃縮（即除去溶劑）的目的則費(fèi)時(shí)較長。

透析袋吸附法是將透析液換成可以吸水的溶液或者固體吸附劑，這樣可實(shí)現(xiàn)很好的濃縮作用。第21頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二2.1透析袋吸附法具體操作： 將蛋白質(zhì)溶液加入到透析袋中（無透析袋可以用玻璃紙代替），結(jié)扎好后將PEG、蔗糖等吸附劑撒在透析袋外；或者把吸水劑配成30%-40%的溶液，將裝有蛋白質(zhì)溶液的透析袋放入吸附劑溶液中。吸水劑用過后，可放入溫箱中烘干或自然干燥后重復(fù)利用。優(yōu)缺點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)：該方法簡單高效，操作過程中可以保持蛋白質(zhì)不變性，吸附劑可回收利用。 缺點(diǎn)：蛋白質(zhì)可能吸附在透析膜上，導(dǎo)致回收率低。操作過程需要低溫。第22頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二2.2凝膠吸附法定義：凝膠是一種惰性多孔聚合物，孔徑較小的凝膠具有很強(qiáng)的吸水性，適宜濃縮分子量在10000以上的蛋白質(zhì)。 常用的凝膠有SephadexG系列以及Bio-GelP系列凝膠。具體操作：將干的凝膠加入到蛋白質(zhì)溶液中吸收水分子和其他小分子，當(dāng)凝膠完全膨脹后，用過濾或立信德方法除去凝膠，即可得到濃縮后的蛋白質(zhì)溶液。注意事項(xiàng)：溶液的pH值應(yīng)大于被濃縮物質(zhì)的等電點(diǎn)，否則在凝膠表面會(huì)產(chǎn)生陽離子交換，影響蛋白質(zhì)的回收率。第23頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二3.1原理3.2操作過程3.真空冷凍干燥法第24頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二3.1原理 凍干法是指將蛋白質(zhì)溶液在低溫下凍結(jié)，然后在真空條件下升華干燥，除去冰晶，待升華結(jié)束后再進(jìn)行解吸干燥，除去部分結(jié)合水的干燥方法，最終達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。第25頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二3.1原理蛋白凍干粉冷凍初級干燥二次干燥避光貯存冷凍速率會(huì)影響最終產(chǎn)品的質(zhì)量。慢速冷凍，快速冷凍。>80%的溶劑被除去，殘留的溶劑以濕氣的形式吸附在產(chǎn)品上。殘留溶劑降低到足以抑制微生物生長或化學(xué)反應(yīng)發(fā)生的水平，同時(shí)保持了凍干蛋白的活性和完整性。需要使用時(shí)，加蒸餾水或生理鹽水制成懸浮液，即可恢復(fù)原狀態(tài)。第26頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二3.2操作過程油面一定不能低于油鏡的中線。嚴(yán)禁無油或低油位開啟真空泵。第27頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二4.1原理4.2超濾裝置及類型4.超濾法4.3超濾膜的選擇4.4注意事項(xiàng)第28頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二4.1原理超濾（Ultrafiltration）技術(shù)是一種膜濾法，也有錯(cuò)流過濾（CrossFiltration）之稱。其基本原理是在常溫下以一定壓力和流量，利用不對稱微孔結(jié)構(gòu)和半透膜介質(zhì)，依靠膜兩側(cè)的壓力差作為推動(dòng)力，以錯(cuò)流方式進(jìn)行過濾，使溶劑及小分子物質(zhì)通過，大分子物質(zhì)和微粒子如蛋白質(zhì)、水溶性高聚物、細(xì)菌等被濾膜阻留，從而達(dá)到分離、分級、純化、濃縮目的的一種新型膜分離技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)室常用超濾管和冷凍離心機(jī)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)溶液的超濾濃縮。第29頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二4.2裝置及類型第30頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二4.2裝置及類型超濾裝置裝置較簡單，只是在密閉的容器中施加一定壓力，使小分子和溶劑分子擠壓出膜外。無攪拌裝置濃差極化嚴(yán)重，只適于濃度較稀的少量超濾。

超濾裝置位于電磁攪拌器之上。向容器內(nèi)施加壓力的同時(shí)開動(dòng)磁力攪拌器，大分子向?yàn)V膜表面堆積時(shí)，被電磁攪拌器分散到溶液中。濃度極化較弱，超濾速度略有提高。在一支空心柱內(nèi)裝有許多中空纖維毛細(xì)管，兩端相通，管的內(nèi)徑一般在0.2mm左右，有效面積可以達(dá)到1平方厘米。極大地提高了超濾速度。攪拌式超濾無攪拌式超濾中空纖維超濾第31頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二4.3超濾膜的選擇超濾技術(shù)的關(guān)鍵是膜。常用的膜一般是由乙酸纖維或硝酸纖維或此二者的混合物制成。近年來為適應(yīng)制藥和食品工業(yè)上滅菌的需要，發(fā)展了非纖維型的各向異性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。這種膜在pH1～14都是穩(wěn)定的，且能在90℃下正常工作。超濾膜通常是比較穩(wěn)定的，若使用恰當(dāng)，能連續(xù)用1～2年。暫時(shí)不用，可浸在1％甲醛溶液或0.2％疊氮化鈉NaN3中保存。第32頁，共35頁，2023年，2月20日，星期二超濾膜相對流速(ml/min/cm2)性能特點(diǎn)聚醚砜，pH范圍1~143,000MWCO0.05肽的回收率高5,000MWCO0.24肽的回收率高，流速較快10,000MWCO0.41應(yīng)用范圍廣，流速快，吸附低30,000MWCO0.41應(yīng)用范圍廣，流速快50,000MWCO0.45精確的截留分子量限100,000M