MIQE指南：RT-qPCR中的定量策略詳解

———MIQE指南：RT-qPCR中的定量策略詳解

1.簡介

MIQE(MinimumInformationforPublicationofOuantitativeReal-TimePCRExperiments)指南是關(guān)于qPCR實驗發(fā)表文章時所必需的實驗信息提出的最低限度的標準。目的是讓作者能夠設(shè)計和報告更有價值的qPCR實驗，使評閱人員和編輯按照相應(yīng)的標準來評價所提交的文稿的技術(shù)質(zhì)量，使讀者更容易重復(fù)按照該指南發(fā)表的實驗研究。本文我將為大家詳細介紹如何應(yīng)用MIQE指南來指導(dǎo)RT-qPCR中的定量策略。

2.

當準備進行qPCR實驗時，首先需要確定實驗該如何設(shè)計，要做絕對定量還是相對定量呢？絕對定量要怎么做？相對定量又是怎么做？本文將重點介紹量化策略類型的優(yōu)缺點，從而深入了解其局限性以及RT-qPCR效率如何影響量化結(jié)果。

3.定量策略

絕對定量使用標準(或校準)曲線將PCR數(shù)據(jù)與輸入拷貝數(shù)相關(guān)聯(lián)。因此，該校準曲線用于確定未知分析物的濃度。盡管傳統(tǒng)上稱為"絕對定量'，但最好將這種方法稱為"校準定量'。這是因為，在這種情況下，"絕對'一詞具有誤導(dǎo)性，因為現(xiàn)場樣品的濃度實際上是與校準曲線中使用的標準樣品的濃度"相對'測量的。此外，數(shù)據(jù)的可靠性還依賴于RT-qPCR中待測靶標和標準曲線的"相同'的擴增效率。

相對定量不需要校準曲線。由于這個原因，乍看比絕對定量更容易執(zhí)行。相對定量用于測量mRNA表達相對于所選對照樣品的變化，它主要基于靶基因相對于一個或多個內(nèi)源性表達參考基因（管家基因）的表達。相對定量方法對于大多數(shù)實驗?zāi)康氖亲銐虻模缪芯縨RNA或microRNA基因在不同生理條件下的表達變化。用于表示相對量的單位通常為"x倍變化'，并且可以在多個實驗中比較相對量。

▲圖1符合MIQE指南的RT-qPCR定量檢測

4.絕對定量

絕對定量需要用已知濃度的標準品繪制標準曲線來推算未知樣品的量，將標準品稀釋成不同濃度，作為模板進行PCR反應(yīng)。以標準品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，以測得的Cq值為縱坐標繪制標準曲線：Cq=-klgX0+b。對未知樣品進行定量時，根據(jù)未知樣品的Cq值，即可在標準曲線中得到樣品的拷貝數(shù)。

▲圖2RNA標準曲線

從上圖可以發(fā)現(xiàn)，當模板起始濃度越大時，熒光達到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Cq值越小。反之，模板起始濃度越小時，Cq值越大。

為了保持與實際檢測樣品間的擴增效率的一致性，作為標準品應(yīng)盡量選擇與實際檢測樣品結(jié)構(gòu)近似的樣品。以基因組DNA為模板時就要選擇基因組DNA作為標準品；進行mRNA表達解析時最好選擇表達目的基因的TotalRNA(或以TotalRNA為模板合成的cDNA)作為標準品。即使擴增堿基序列相同，但整體模板不同，也有可能導(dǎo)致PCR擴增效率不同（比如基因組DNA和質(zhì)粒DNA等）。

建立標準曲線，需要已知拷貝數(shù)濃度的標準品，對標準品進行5個以上的連續(xù)梯度稀釋，將稀釋的標準品進行實時熒光定量PCR擴增。最后根據(jù)各樣品的拷貝數(shù)濃度及相應(yīng)的Cq值繪制標準曲線，得到線性方程：Cq=-klgX0+b，其中X0為起始模板量。然后將未知樣本的Cq值與此標準曲線進行比較，確定其拷貝數(shù)。5.相對定量

相對定量是用于測定兩個或多個不同樣品中靶基因量的差異，得到的數(shù)據(jù)是目的基因在各樣本中含量的相對比例。即將實驗樣本中靶基因的Cq值與對照樣本的Cq值進行比較，結(jié)果用實驗樣本中靶基因量與對照樣本中靶基因量的比值或差異倍數(shù)來表示。該方法在qPCR定量檢測mRNA水平中最常見，研究生理變化對基因表達水平的影響。比如研究不同藥物處理對Actin基因表達量的影響，就可以使用相對定量方法來研究。

相對定量需要確保實驗樣本與對照樣本的靶基因從等量原料中得到。Cq值與起始樣品模板量的濃度相關(guān)，但是兩組樣品間濃度能否調(diào)至完全相同呢？這就要求樣品細胞起始數(shù)、RNA提取效率、逆轉(zhuǎn)錄以及定量效率及操作必須完全一致，不存在操作誤差等，這顯然是無法達到的。最常用的是引入內(nèi)參基因?qū)颖镜牟町愡M行歸一化。

6.內(nèi)參基因選擇

選擇合適的單個參考基因或選擇合適的參考基因組對于準確的RT-qPCR基因表達分析是極為關(guān)鍵的，并且是MIQE指南的必需報告內(nèi)容。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該具備以下幾個條件：

①不存在假基因(pseudogene)，以避免基因組DNA的擴增；

②高度或中度表達，排除太高或低表達；

③穩(wěn)定表達于不同類型的細胞和組織(如正常細胞和癌細胞)，而且其表達量是近似的，無顯著性差別；

④表達水平與細胞周期以及細胞是否活化無關(guān)；

⑤其穩(wěn)定的表達水平與目標基因相似；

⑥不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受任何實驗處理措施的影響。

針對在不同條件下表達差異的基因、呈現(xiàn)細胞周期性依賴表達的基因以及定位于X染色體的基因，都不是作為內(nèi)參基因的首要選擇。

7.RT-qPCR數(shù)據(jù)的歸一化

相對定量時采用內(nèi)參基因進行歸一化，然后使用將歸一化的數(shù)值進行比較得出差異倍數(shù)。對照樣本的歸一化后靶基因表達量被設(shè)置為"1'，實驗樣本的歸一化后靶基因表達量以對比對照樣本增加或降低x倍來表示。

相對定量的數(shù)據(jù)計算方法通常有2種：相對標準曲線法和比較Cq值法。標準曲線法中，先用標準曲線確定實驗樣本和對照樣本中靶基因和內(nèi)參基因的量，再用內(nèi)參基因歸一化兩個樣本中靶基因量。相對定量中的標準品的濃度無需已知。由于標準曲線法需要每一個待測基同內(nèi)參基因一起單獨做標準曲線，工作量大，成本高，只適合僅分析1個或幾個基因的低通量實驗。因此日常實驗中常用的方法是比較Cq值法，即2-△△Cq法，計算方法如下：

步驟1：內(nèi)參基因均一化樣本差異

目的基因平均Cq值-內(nèi)參基因平均Cq值=Cq

步驟2：處理和對照樣本比較

Cq處理樣本-Cq對照樣本=Cq

步驟3：使用公示計算

倍數(shù)變化=2-△△Cq

此公式用于計算所有待測樣本與對照樣本之間目的基因表達量的倍數(shù)變化，若F值=A（A＞1），則代表待測樣本相對于對照樣本表達量上調(diào)A倍；反之若F值=B（1＞B＞0），則代表待測樣本相對于對照樣本表達量下調(diào)1/B倍。

值得注意的是，2-△△Cq法需保證目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率基本一致才可使用。同時擴增目的基因和內(nèi)參基因，通過查看擴增曲線中指數(shù)增長期是否平行來確定擴增效率是否相似；或制作標準曲線計算每一對引物的擴增效率。

8.RT-qPCR擴增效率

PCR的效率取決于許多因素，既存在抑制劑也存在增強劑，如下圖所示。在所有比較樣品中穩(wěn)定和恒定的擴增效率是樣品之間實現(xiàn)可靠比較的一個重要標準?！鴪D3影響PCR擴增效率的因素

一種有效的用來確定qPCR實驗是否是最優(yōu)化的方法：將模板稀釋成一系列濃度梯度進行PCR反應(yīng)，用這個結(jié)果作標準曲線，模板可以用已知濃度的樣品(如納克級的基因組DNA或多個拷貝的質(zhì)粒DNA)或未知濃度的樣品(如cDNA)。用模板初始量(或未知量樣品的稀釋倍數(shù))的log值對每個稀釋樣品的Cq值作圖，兩者呈遞減的線性關(guān)系，稱之為標準曲線。至少需要做3次平行重復(fù)，并至少做5個數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度，繪制標準曲線，得到線性方程Cq=-klgX0+b。理論上，一系列稀釋樣品的擴增曲線之間有均勻的間距，如果產(chǎn)物在每一循環(huán)都加倍，熒光曲線之間的間距由等式2n=稀釋倍數(shù)決定，這里n是閾值線上擴增曲線之間的循環(huán)數(shù)(Cq值)的差異。例如，10倍稀釋的DNA樣品，2n=10，因此，n=3.32，即k=3.32，制作完標準曲線后，需要對其進行評估，評估指標有兩個，相關(guān)系數(shù)R2和擴增效率（E）。相關(guān)系數(shù)R2反應(yīng)了數(shù)據(jù)的線性關(guān)系，主要用來評估重復(fù)樣品的可重復(fù)性和不同濃度的初始模板是否具有相同的擴增效率。R2值應(yīng)大于0.98，該值越接近1，表示線性關(guān)系越好，數(shù)據(jù)越準確。

擴增效率（E）計算公式：E=10-1/斜率-1。一般認為擴增效率應(yīng)介于90~110%之間，與之相對應(yīng)的斜率介于-3.58~-3.1之間。9.使用效率校正計算基因表達倍數(shù)

由于PCR效率在基因、測定、樣品、試劑和儀器之間變化，引入實時PCR效率（E）校正有助于提供更準確的相對定量。然后將相對倍數(shù)變化定義為：在這種情況下，計算步驟如下：

1.計算對照樣品（control）和待測樣品（treatment）之間目的基因（GOI）的Cq差異。

2.計算對照樣品（control）和待測樣品（treatment）內(nèi)參基因（REF）的Cq差異。

3.確定每個基因（GOI和REF）的PCR擴增效率。

4.相對表達比（R）代表與未處理對照組相比，一個GOI經(jīng)歷處理后的"x倍變化'，用REF的穩(wěn)定表達進行歸一化，計算中采用REF或GOI基因的最佳PCR效率E。

10.總結(jié)

用于可靠的mRNA或microRNA定量策略必須根據(jù)需要解決的生物學(xué)問題去設(shè)計。為了做到真實、可信和符合MIQE指南要求，所應(yīng)用的定量策略必須經(jīng)過高度優(yōu)化和驗證。近年來，科學(xué)家已經(jīng)開發(fā)出許多軟件工具使定量過程標準化并使結(jié)果可再現(xiàn)。這些工具及MIQE指南應(yīng)用最終目的是降低運行、檢測和所用SOP之間的實驗室內(nèi)變異性。此外，也有利于實時RT-PCR平臺、分析軟件工具之間以及全球不同實驗室之間的