抗體的制備方法及原理介紹

———抗體的制備方法及原理介紹

抗體的制備方法及原理有哪些？分兩個層面為大家一一介紹：

一、抗血清的制備

有了質(zhì)量好的抗原，還必須選擇適當(dāng)?shù)拿庖咄緩?，才能產(chǎn)生質(zhì)量好（特異性強(qiáng)和效價高）的抗體。

（一）用于免疫的動物

作免疫用的動物有哺乳類和禽類，主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實驗室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。動物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)目，如一般制備抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因動物反應(yīng)良好，而且能夠提供足足數(shù)目的血清，用于免疫的動物應(yīng)適齡，健壯，無感染性疾患，最好為///雄性，此外還需十分留意動物的飼養(yǎng)，以消除動物的個體差異以及在免疫過程中死亡的影響。若用兔，最好用純種新西蘭兔，一組三只，兔的體重以2～3kg為宜。

（二）免疫途徑

免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等，一般常用皮下或背部多點皮內(nèi)注射，每點注射0.1ml左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學(xué)活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。

（三）佐劑

由于不同個體對同一抗原的反應(yīng)性不同，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強(qiáng)有弱，因此經(jīng)常在注射抗原的同時，加進(jìn)能增強(qiáng)抗原的抗原性物質(zhì)，以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，這種物質(zhì)稱為免疫佐劑。

佐劑除了延長抗原在體內(nèi)的存留時間，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多，促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用，從而增強(qiáng)機(jī)體對抗原的細(xì)胞免疫和抗體的產(chǎn)生。

常用的佐劑是福氏佐劑（Freundadjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例，視需要可調(diào)整為1：2～9（V/V），這是不完全福氏佐劑，在每毫升不完全佐劑加進(jìn)1～20mg卡介苗就成為完全佐劑。

（四）免疫方法

抗原劑量，首次劑量為300～500g，加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑量為1/4左右。每2～3周加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫時用不完全佐劑，首次免疫時皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加強(qiáng)免疫時不必注射百日咳疫苗。

在第2次加強(qiáng)免疫后2周，從耳緣靜脈取2～3ml血，制備血清，檢測抗體效價（見后）。如未達(dá)到預(yù)期效價，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿足時為止（圖2-3）。當(dāng)抗體效價達(dá)到預(yù)期水平時，即可放血制備抗血清。

（五）抗血清的采集與保存

家兔是最常用以產(chǎn)生抗體的動物，因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動物以頸靜脈、動脈取血，鼠等小動物取血可參閱有關(guān)資料。取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動脈放血，一是頸動脈進(jìn)血，也可心臟采血。取動脈或靜脈放血時，將兔放進(jìn)一個特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱（籠）外，也可由另一人捉住兔身。剪往耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管擴(kuò)張、充血。用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片，快速切開動脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30～40ml。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗往二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次放血。頸動脈放血時，將兔仰臥，固定于兔臺，剪往頸部的毛，切開皮膚，暴露頸動脈，插管，放血。放血過程中要嚴(yán)格按無菌要求進(jìn)行。

血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4℃下，過夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10min。在無菌條件，吸出血清，分裝（0.05～0.2ml），貯于-40℃以下冰箱，或凍干后貯存于4。C冰箱保存。

（六）抗血清質(zhì)量的評價

在免疫期間，不僅各個不同的動物，而且同一動物在不同的時間內(nèi)抗血清效價、特異性、親協(xié)力等都可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測試。只有在對抗血清的效價、特異性、親協(xié)力等方面作徹底的評價后，才可使用所取得的抗血清。

（七）免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施

有時不能獲得滿足的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進(jìn)之。

（1）免疫動物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動物的種屬或品系，或擴(kuò)大免疫動物的數(shù)目。

（2）抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進(jìn)提取方法。

（3）制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯(lián)劑，載體、抗原或載體的比例、反應(yīng)時間等多方面往考慮，并加以改進(jìn)。

（4）所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強(qiáng)乳化。

（5）免疫的方法、劑量，加強(qiáng)免疫的間隔時間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適。

（6）動物的飼養(yǎng)是否得當(dāng)，如營養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（透風(fēng)、采光、溫度）是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。

二、單克隆抗體的制備

1975年Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交瘤細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無性繁殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破使血清學(xué)的研究進(jìn)進(jìn)了一個高度精確的新紀(jì)元。

免疫細(xì)胞化學(xué)的技術(shù)關(guān)鍵之一是制備特異性強(qiáng)、親協(xié)力大、滴度高的特異性抗體，由于每種抗原都有幾個抗原決定簇，用它免疫動物將產(chǎn)生對各個決定簇的抗體，