轉(zhuǎn)基因動物與生物反應(yīng)器

轉(zhuǎn)基因動物與生物反應(yīng)器第1頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二將特定的目的基因從某一生物體分離出來，進行擴增和加工，再導(dǎo)入另一動物的早期胚胎細胞中，使其整合到宿主動物的染色體上，在動物的發(fā)育過程中表達，并通過生殖細胞傳給后代。這種在基因組中穩(wěn)定整合有人工導(dǎo)入外源基因的動物稱為轉(zhuǎn)基因動物（transgeneticanimal）。引言第2頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二1.轉(zhuǎn)基因牛①從屠宰場殺掉的奶牛體內(nèi)收集卵母細胞，并使之在體外成熟⑦用公牛精液對成熟卵母細胞進行體外受精；②受精卵離心，濃縮卵黃；④將欲導(dǎo)入的DNA微注射到當(dāng)前核中；⑤對胚胎進行體外培養(yǎng)；⑥利用非外科移植術(shù)將一個胚胎植入發(fā)情的代孕母牛子宮內(nèi)；⑦對子代進行DNA檢測，確定是否存在轉(zhuǎn)入基因。轉(zhuǎn)基因動物研究現(xiàn)狀第3頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二第4頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二2.轉(zhuǎn)基因綿羊、山羊和豬囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子第5頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二在山羊奶中生產(chǎn)ATT第6頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二3.轉(zhuǎn)基因禽類第7頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二4.轉(zhuǎn)基因魚第8頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二將克隆的外源基因注射到一個受精卵的細胞核中；接種后的受精卵移植到雌性受體的子宮，使其順利完成胚胎發(fā)育；移植后的受精卵發(fā)育生長為后代，其中的部分后代其細胞中都攜帶有轉(zhuǎn)入的外源基因；利用這些能產(chǎn)生外源蛋白的動物作為種畜或種禽，培育新的純合系。第9頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二外源目的基因的制備外源目的基因有效導(dǎo)入生殖細胞或胚胎干細胞選擇獲得攜有目的基因的細胞選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物轉(zhuǎn)基因細胞胚胎發(fā)育及鑒定篩選所得的轉(zhuǎn)基因動物品系轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)路線第10頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二9.1目的基因的制備9.1.1目的基因的來源9.1.2目的基因的克隆9.1.3目的基因的轉(zhuǎn)移第11頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二9.1.1目的基因的來源采用限制性內(nèi)切酶，從生物組織中獲取目的基因；通過mRNA合成cDNA；人工合成的DNA片段；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增特定基因片段。第12頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二9.1.2目的基因的克隆通過載體在適當(dāng)?shù)乃拗髦锌寺∵x擇載體目的基因與載體的連接重組體導(dǎo)入受體細胞通過PCR反應(yīng)克隆目的基因第13頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二9.1.3目的基因的轉(zhuǎn)移電穿孔法顯微注射法裸露DNA直接注射磷酸鈣—DNA共沉淀法脂質(zhì)載體包埋法病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法第14頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二A.電穿孔法

實現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移利用脈沖電場提高細胞膜的通透性，從而使外源DNA轉(zhuǎn)移至細胞中。此法簡單、效率較高，廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)細胞的基因轉(zhuǎn)移。第15頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)B.利用顯微操作技術(shù)轉(zhuǎn)移外源基因的方法。

此法轉(zhuǎn)入基因長度可達數(shù)百kb；并能隨機地整合在受體細胞染色體DNA上，因此應(yīng)用范圍廣。但是這種整合有時會導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動物基因組的重排、易位、缺失或定點突變。第16頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二C.磷酸鈣—DNA共沉淀法這種方法是受二價金屬離子能促進細胞吸收外源DNA的啟發(fā)而發(fā)展起來的。當(dāng)核酸以磷酸鈣—DNA共沉淀物的形式在時，細胞攝取DNA的能力顯著加強。但轉(zhuǎn)移效率較低，僅有1%~5%的外源DNA可以進入受體細胞核中，大約僅有1%的DNA可以在細胞中穩(wěn)定表達。第17頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二D.脂質(zhì)載體包埋法將需要轉(zhuǎn)移的外源DNA或RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，由于脂質(zhì)體具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)，與細胞膜類似，因此可以與受體細胞膜融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入宿主細胞。這種方法轉(zhuǎn)基因效率高。第18頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法第19頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二9.2轉(zhuǎn)基因動物的培育技術(shù)基因顯微注射法胚胎干細胞移植法反轉(zhuǎn)錄病毒法精子載體導(dǎo)入法YAC介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移細胞核移植技術(shù)第20頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二何為顯微注射？顯微注射就是借助光學(xué)顯微鏡的放大作用，利用顯微操作儀，直接把DNA注射到動物早期胚胎、胚胎干細胞、體細胞或卵母細胞中，然后生產(chǎn)動物個體的技術(shù)。經(jīng)過顯微注射DNA發(fā)育而成的動物中，有少數(shù)整合了被注射的DNA分子，成為轉(zhuǎn)基因動物。9.2.1基因顯微注射法第21頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二通過激素療法使小鼠超數(shù)排卵，開始時注射雌性妊娠血清，48小時后再注射人絨毛膜促性腺激素，這時小鼠便會超數(shù)排卵，一般情況下5-10個，超數(shù)排卵為35個；與雄性小鼠交配，然后殺掉小鼠，從其輸卵管內(nèi)取出受精卵；將經(jīng)純化的轉(zhuǎn)基因樣品迅速注射入受精卵中變大的雄性原核內(nèi)；DNA顯微注射法的基本程序第22頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二將25-40個注射了轉(zhuǎn)基因的受精卵移植入代孕小鼠體內(nèi)；受精卵發(fā)育成胚胎，并繁殖成轉(zhuǎn)基因小鼠子代；從小鼠子代體內(nèi)取出DNA樣品進行雜交，鑒定轉(zhuǎn)基因的整合與否及位點；子代小鼠間進行再交配，繁殖，觀察轉(zhuǎn)基因是否遺傳及表達。第23頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二通過DNA顯微注射獲得轉(zhuǎn)基因小鼠示意圖第24頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二1.顯微注射DNA的制備與純化DNA構(gòu)型和末端結(jié)構(gòu)載體DNA的長度與濃度溶解DNA的緩沖液DNA的純度第25頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二2.鼠的準(zhǔn)備與要求轉(zhuǎn)基因鼠實驗所用各類鼠第26頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二3.超排卵與取卵孕馬血清（PMS）其有效成分為卵泡刺激素（FSH）。人絨毛膜促性腺激素（hGG）雌鼠的排卵時間：PM10.00~12.00雄鼠的排精時間：PM10.00~12.00受精一般發(fā)生在：AM1.00超排卵第27頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二制定排卵程序：(1)于第一日中午先向小鼠腹腔內(nèi)注入5一l0單位的PMS；(2)過48小時(第三天中午)腹腔內(nèi)注入5—10單位的人hCG(注射后11—13小時后排卵)；(3)令雌雄動物一對一的合籠交配；動物半夜交尾，如未發(fā)生交配，兩周后可再重用，但成功率下降；(4)檢查陰栓(第四日晨)；檢查陰栓可判定是否受精；如已受精則出現(xiàn)陰栓。第28頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二2受精卵的收集(1)檢查陰栓：有白色陰栓的小鼠可用，引頸處死動物：(2)取輸卵管：剖開腹腔取出輸卵管，置入含有3ml培養(yǎng)液的60mm直徑的瓶皿中；(3)取卵子；在20×或50×解剖鏡下找到輸卵管，在卵管膨大的壺腹部(于卵管開口近處)隱約可見內(nèi)含的胚卵，把胚卵團用尖攝輕輕壓擠出，用吸管移入含有400l分離液的表玻皿中；第29頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二(4)另準(zhǔn)備4—5個平皿，每皿內(nèi)均充有胚胎培養(yǎng)基400l并覆蓋有厚8mm硅烷油或液體石蠟層(Fisher產(chǎn)，研究用)，硅烷油和石蠟巳預(yù)先在5%CO2中置37℃1小時做平衡處理。覆硅烷油或石蠟層的目的是為防止培養(yǎng)液蒸發(fā)、散熱和pH改變；第30頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二(5)向含卵團表玻皿的分離液中加5l新制備的透明質(zhì)酸酶(透明質(zhì)酸酶10mg／1ml分離液，Sigma產(chǎn))，把胚卵團消化分散開；(6)當(dāng)卵團散開后，立即把分散游離的卵細胞用吸管轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)皿中，通過硅油層接種入任一培養(yǎng)液小滴中)，以清除酶的繼續(xù)作用；(7)再依次通過皿內(nèi)其余培養(yǎng)液小滴，以繼續(xù)除掉酶和擺脫碎片(碎片能堵塞吸管口)，此時的卵己可用作DNA注射之用。第31頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二4.DNA顯微注射1）制備持卵管與注射針持卵管制備：在火焰燈上將微玻璃管拉成中間較細的約5~10cm長的一段，其口徑約80~120m，用玻璃刀將其在離頸部2cm處切斷，再把切口燒成如圖形狀，口徑約15m。將尖部移近火焰噴燈略加熱，用鑷子輕觸尖部適宜位置，使變成如圖所示角度。注射針的制備：由拉針器制成，針的口徑應(yīng)低于1m。第32頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二第33頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二（1）硅烷油注入：取培養(yǎng)皿或表玻皿，注入已經(jīng)過平衡處理過的液體硅烷油或石蠟（厚約5mm）；（2）加培養(yǎng)基：通過硅烷油或石蠟層向培養(yǎng)皿底接種培養(yǎng)液，以100l為單元的小滴數(shù)個，各滴間相距1一2cm(視小滴多少而定)；（3）胚卵接種：吸取待受注射胚卵數(shù)個，通過油層分別接種入培養(yǎng)液小滴中；2DNA注射第34頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二（4）DNA準(zhǔn)備：從Eppendorf管中取一份DNA后；用75%乙醇漂洗后，真空中干燥，重懸于注射緩沖液中(含1mgDNA／ml)，使其最終濃度為：0.05~0.5mg/ml（5）于臨注射前把DNA樣品在Eppendorf管中再離心一次(1200rpm，10分鐘)，以消除末溶解物，防止阻塞注射管口；（6）把待注射用的DNA裝入注射管中；第35頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二（7）在顯微鏡下把支持吸管轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)液小滴中，選一健康胚卵；先吸少量培養(yǎng)液，僅令充入吸管末端，然后吹出；在吸管保持負壓狀態(tài)下吸住胚卵，繼之把支持管調(diào)至皿底令胚卵靠于皿底面中央部；（8）調(diào)注射針至胚卵近處，先調(diào)顯微鏡焦點看清針尖，然后通過透明帶刺入胚卵細胞膜內(nèi)(小鼠胚卵直徑約10m)，進而繼續(xù)進針再刺入任一原核內(nèi)（雄性原核多位于周邊部，體積較大，為主要注射對象）。注射針刺入細胞內(nèi)進行注射時，如細胞核微微發(fā)生膨脹，證明DNA已被注入，反之需重新進行注射；注射細胞數(shù)量越多越好；第36頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二（9）用支持吸管把已注射細胞移入另一培養(yǎng)小滴中，使之與未注射細胞分開；待注射結(jié)束后，把所有細胞均移入培養(yǎng)液中，置入溫箱培養(yǎng)30分種；（10）鏡下觀察細胞，發(fā)現(xiàn)有溶解死亡崩潰者棄掉。第37頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二第38頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二5.體內(nèi)接種（1）在手術(shù)前夜令受體母鼠與已結(jié)扎輸精管雄性小鼠合籠，次日晨取出雌鼠備用；（2）取注射吸管兩支，分別作為向兩側(cè)輸卵管注入胚卵之用；先吸入少許培養(yǎng)液，排出后留少許液體并保留一兩個氣泡，繼之吸入胚卵數(shù)個(在管腔內(nèi)成串)；最后仍保留一個氣泡，以使管內(nèi)胚卵限制于氣泡之間不易移動并利于識別；第39頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二（3）麻醉小鼠，深度適當(dāng)，置動物于小手術(shù)平臺上，呈腹臥位(背朝上)；（4）剪出背腎部兩側(cè)毛，碘酒／酒精消毒；（5）使動物軀干部一側(cè)斜向上，在髂骨和腎臟下方間剪一縱切口，長2cm；（6）輕輕牽出輸卵管，找尋輸卵管口(剛排卵動物輸卵管壺腹部微膨脹，內(nèi)可見成團未受精卵子)一手用鑷子輕輕持住輸卵管系膜，另一只手持一個含有胚卵的注入管，伸入輸卵管口內(nèi)，把吸管內(nèi)已含有外源DNA的胚卵全部注入輸卵管內(nèi)；第40頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二（7）把輸卵管及周圍組織送回腹腔內(nèi)；（8）仔細緊密縫合創(chuàng)口，（9）再令動物倒向另側(cè)；按同樣操作方法向該側(cè)輸卵管內(nèi)輸入同等量的胚卵。第41頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二第42頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二6.顯微注射法獲得轉(zhuǎn)基因鼠的成活率第43頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二優(yōu)點：轉(zhuǎn)基因范圍廣，轉(zhuǎn)移基因大，可達數(shù)百kb；且轉(zhuǎn)基因不含任何病毒基因組片段，絕對安全。缺點：整合機制不明確，無規(guī)律隨機整合，多拷貝整合導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因不表達；整合位點隨機會造成轉(zhuǎn)移動物基因組的重排、突變、易位缺失等；需顯微操作儀，技術(shù)性要求強。第44頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二胚胎干細胞（embryonicstemcell，ES）是從早期胚胎內(nèi)細胞團（ICM）分離出來的，能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的多能干細胞。它是一種含正常二倍體染色體的具有發(fā)育全能性的細胞。可以在體外進行人工培養(yǎng)，擴增，并能以克隆的形式保存。9.2.3胚胎干細胞方法第45頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二第46頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二1.ES細胞的建立與維持動物的準(zhǔn)備：取受精之后3.5天的母鼠分離鼠胚。胚胎的分離和初培養(yǎng)：3.5天孕鼠鼠斷頸處死解剖小鼠取出胚胎體外培養(yǎng)胚胎4—6天后，離散ICM。ICM的離散與ES的分離：分離ICM酶解細胞團培養(yǎng)離散細胞ES細胞集落ES細胞的擴增：離散ES細胞置四孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)ES細胞的常規(guī)培養(yǎng)：ES細胞由四孔板轉(zhuǎn)至培養(yǎng)皿進行常規(guī)培養(yǎng)第47頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二第48頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二2.ES細胞的基因組操作將外源基因移入到ES細胞基因組后，既能高效穩(wěn)定表達，又不影響ES細胞的各種功能。這就要求目的基因必須要定點參入，并且參入整合后，對原有基因結(jié)構(gòu)及功能沒有影響或影響最小。第49頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二與整合位點兩端區(qū)域同源的兩段DNA序列（HB1和HB2）轉(zhuǎn)入的目的基因（TG）編碼抗G418的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（neor）兩個不的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2）第50頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二3.轉(zhuǎn)基因ES細胞的篩選——正負選擇法

正選擇法篩選出轉(zhuǎn)基因整合型ES細胞：通過物理方法將重組DNA分子導(dǎo)入ES細胞，在含有抗菌素G418的培養(yǎng)基中，沒有整合外源基因的細胞將全部死亡，只有整合了外源基因的細胞才可以存活下來。負選擇法篩選出特異整合型ES細胞：如果非特異性整合發(fā)生，則兩個tk基因或其中一個基因很大可能與TG和neor一起整合，這時用GCV篩選，tk基因表達的胸苷激酶能反GCV(環(huán)鳥苷)轉(zhuǎn)化成毒性氨基酸，使細胞死亡。這是負選反擇。第51頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二4.轉(zhuǎn)基因ES細胞的檢測第52頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二5.轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育正確整合的轉(zhuǎn)基因胚胎干細胞經(jīng)培養(yǎng)后就可以移入胚泡期的供體胚胎了。將這些胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宮內(nèi)，繁育轉(zhuǎn)基因小鼠。第53頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二6.獲得純合的轉(zhuǎn)基因鼠第54頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二優(yōu)點：基因轉(zhuǎn)移效率大大提高，且能進行定位基因轉(zhuǎn)移。缺點：需要多代才能得到純合的轉(zhuǎn)基因動物，這對飼養(yǎng)成本高，產(chǎn)仔數(shù)較少的大型哺乳類動物來說，要獲得轉(zhuǎn)基因動物是一件需要大量資金投入的事情。第55頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二1.反轉(zhuǎn)錄病毒感染法的原理9.2.3反轉(zhuǎn)錄病毒法第56頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二2.反轉(zhuǎn)錄病毒感染法的載體的構(gòu)建提取病毒未整合的環(huán)狀形式DNA；將環(huán)狀DNA克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中；選擇適當(dāng)?shù)拿笇⒉《窘Y(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)切除；將外源目的基因克隆到載體中第57頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二3.通過物理方法將重組DNA分子轉(zhuǎn)入包裝細胞

反轉(zhuǎn)錄病毒載體的工作原理：寄生在受體細胞中的重組病毒由于沒有包裝信號，能生產(chǎn)病毒RNA和所有蛋白質(zhì)，但不能包裝成病毒顆粒；病毒載體轉(zhuǎn)化受體細胞后，載體上的包裝信號將使包裝蛋白把載體包裝成為侵染生的病毒顆粒。第58頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二4.重組反轉(zhuǎn)錄病毒感染早期胚胎（1）人為感染著床前或著床后的胚胎。（2）直接將胚胎與能釋放反轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細胞共孵育以達到感染目的。可通過病毒將外源目的基因插入整合到宿主基因組DNA中。

第59頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二優(yōu)點：能有效地將基因整合入受體細胞的基因組內(nèi)，單拷貝整合型；轉(zhuǎn)基因整合后能穩(wěn)定地遺傳；整合機制相應(yīng)明確，在TR區(qū)域內(nèi)進行，不會破壞轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)缺點：載量較小，一般只有8kb，可能會因缺少必須的調(diào)控元件而影響轉(zhuǎn)基因表達；盡管病毒載體被設(shè)計為復(fù)制缺陷型的，但在包裝細胞的包裝過程中，若與整合型輔助表達基因組發(fā)生同源重組，就有可能組裝成野生型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，因此在構(gòu)建具有商業(yè)價值的轉(zhuǎn)基因動物時，一般使用受到限制。操作繁瑣。第60頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二9.2.4精子載體法顯微注射技術(shù)的效率很低，設(shè)備昂貴。直接用精子作為外源DNA載體的轉(zhuǎn)移方法。主要問題：重復(fù)性不好第61頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二基本原理和方法精子直接與外源DNA混合培養(yǎng)，外源基因可以直接進入精子頭部，受精后就可發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。后來Rottman對此方法進行了改進，將外源DNA在與精子共孵育之前用脂質(zhì)體包埋，使脂質(zhì)體與DNA相互作用形成脂質(zhì)體——DNA復(fù)合物。這種復(fù)合體比較容易和精子細胞融合，從而進入細胞內(nèi)。第62頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二DNA的提取斑點雜交和PCR擴增Southern雜交Northern雜交表達產(chǎn)的檢測轉(zhuǎn)基因動物的檢測第63頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二一、轉(zhuǎn)基因動物在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用研究基因的結(jié)構(gòu)與功能研究基因的組織特異性表達研究發(fā)育相關(guān)基因的表達與調(diào)控克隆在發(fā)育中起重要作用的基因基因多級調(diào)節(jié)系統(tǒng)的研究細胞功能研究9.3轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用第64頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二基因打靶基因整合三種方式：基因隨機插入基因敲除基因替換基因打靶第65頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二基因敲除（geneknockout），是指對一個結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計實驗，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實驗動物，推測相應(yīng)基因的功能。這與早期生理學(xué)研究中常用的切除部分——觀察整體——推測功能的三部曲思想相似。第66頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二基因敲除的技術(shù)路線如下：

（1）構(gòu)建重組基因載體﹔

（2）用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA轉(zhuǎn)入受體細胞核內(nèi)﹔

（3）用選擇培養(yǎng)基篩選已擊中的細胞﹔

（4）將擊中細胞轉(zhuǎn)入胚胎使其生長成為轉(zhuǎn)基因動物，對轉(zhuǎn)基因動物進行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測。第67頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二二、轉(zhuǎn)基因動物在醫(yī)藥研究領(lǐng)域中的應(yīng)用研究病毒性疾病研究建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型轉(zhuǎn)基因動物與基因治療生產(chǎn)天然活性藥物蛋白第68頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二轉(zhuǎn)基因動物的低效性轉(zhuǎn)入基因造成宿主基因突變問題轉(zhuǎn)入基因的表達問題病毒轉(zhuǎn)基因研究存在的問題轉(zhuǎn)基因動物模型與預(yù)期不符問題乳腺生物反應(yīng)器的問題社會問題9.2.7轉(zhuǎn)基因動物研究存在的問題第69頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二

一般把目的片段在器官或組織中表達的轉(zhuǎn)基因動物叫動物生物反應(yīng)器（bioreactor），幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經(jīng)過人為馴化為生物反應(yīng)器,從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應(yīng)器選擇的組織和器官要方便產(chǎn)物的獲得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了動物乳腺生物反應(yīng)器,動物血液生物反應(yīng)器和動物膀胱生物反應(yīng)器等。其中，轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器的研究最為引人注目。9.4動物生物反應(yīng)器第70頁，共78頁，2023年，2月20日，星期二微生物反應(yīng)器植物反應(yīng)器動物反應(yīng)器

(一)優(yōu)點1可以利用發(fā)酵工程技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)。2胞外活性物質(zhì)制備容易。

（二）不足1哺乳動物或人類的基因往往不能表達。有些表達了，卻沒有活性，需要進一步修飾。2真核生物蛋白質(zhì)翻譯后加工的精確性有限。3需要大型發(fā)酵設(shè)備和車間。4細菌發(fā)酵常形成不溶聚合物，使下游加工成本增加。

（一）優(yōu)點1可大規(guī)模種植，上游生產(chǎn)成本較低。作為食物可省去下游加工步驟。2轉(zhuǎn)基因植物自交后可得到穩(wěn)定遺傳的遺傳性狀。3可利用植物組織和細胞培養(yǎng)技術(shù)實現(xiàn)大量制備。（二）不足1植物種植受季節(jié)、環(huán)境影響。2需專門的活性物質(zhì)分離設(shè)備與技術(shù)。3植物細胞培養(yǎng)需要發(fā)酵罐等設(shè)備和技術(shù)支持，成本較高。

（一）優(yōu)點1易養(yǎng)殖，實現(xiàn)大規(guī)模制備。2通過乳腺和血液制備活性物質(zhì)簡單易行。3可以通過動物細胞培養(yǎng)實現(xiàn)大量制備。

（二）不足1細胞培養(yǎng)需要昂貴的培養(yǎng)基和設(shè)備。2轉(zhuǎn)基因動物制備成本昂貴。3轉(zhuǎn)基因動物易產(chǎn)生一些倫理問題。