基因工程課件4-實(shí)驗(yàn)3：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

基因工程課件4——實(shí)驗(yàn)3：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)第一頁，共23頁。實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求掌握PCR反應(yīng)原理學(xué)習(xí)引物序列的設(shè)計(jì)學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)程序參數(shù)的設(shè)計(jì)學(xué)習(xí)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在體外大量擴(kuò)增位于兩段已知序列間的DNA區(qū)段。第二頁，共23頁。Contents

一、實(shí)驗(yàn)原理

二、實(shí)驗(yàn)材料

三、實(shí)驗(yàn)步驟

四、預(yù)期結(jié)果

五、注意事項(xiàng)第三頁，共23頁。一、實(shí)驗(yàn)原理1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)簡介

2、基本原理及特點(diǎn)

3、一個(gè)典型PCR的反應(yīng)體系及程序參數(shù)介紹4、DNA聚合酶5、寡核苷酸引物的設(shè)計(jì)

第四頁，共23頁。1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)簡介多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)簡稱PCR技術(shù)，是1983年，美國科學(xué)家K.B.Mullis發(fā)明的一種體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。PCR技術(shù)已迅速滲透到分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，引起了生物技術(shù)發(fā)展的一次革命，目前它在分子克隆，目的基因檢測，遺傳病的基因診斷，法醫(yī)學(xué)，考古學(xué)等方面得到了廣泛的應(yīng)用。第五頁，共23頁。2、PCR技術(shù)基本原理及特點(diǎn)PCR技術(shù)實(shí)際上是在模板DNA，引物和４種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合反應(yīng)，大量擴(kuò)增位于兩段已知序列間的DNA區(qū)段。反應(yīng)主要涉及三個(gè)反應(yīng)的循環(huán)：①高溫變性（denaturation），發(fā)生鏈的分離；②低溫退火（annealing），發(fā)生引物雜交；③適溫延伸（extension），發(fā)生DNA合成。

第六頁，共23頁。PCR反應(yīng)循環(huán)示意圖5’3’3’5’94℃高溫變性雙鏈DNA分離出2條單鏈DNA分子53℃低溫退火5’3’3’5’一對(duì)特異性引物分別結(jié)合到兩條單鏈模板DNA上。上游引物下游引物72℃適溫延伸5’3’3’5’在DNA聚合酶的作用下，dNTPs從引物3’端開始參入，并沿著模板從5’向3’方向延伸，合成出新生的DNA互補(bǔ)鏈。1個(gè)分子2n個(gè)分子n個(gè)循環(huán)第七頁，共23頁。3、一個(gè)典型反應(yīng)的反應(yīng)體系及程序參數(shù)介紹反應(yīng)體系：反應(yīng)物終濃度

10×buffer2μl4×dNTPs(1mM)800μmol/L

MgCl2(25mM)1.5mmol/LDNA聚合酶

1U上游引物P1

400pmol/L下游引物

P2400pmol/L模板ＤＮＡ(20ng)補(bǔ)水至總體積20μl反應(yīng)參數(shù)：溫度

時(shí)間

９4℃

2min９4℃

45s60℃45s72℃

50s72℃

5min

4℃

hold20個(gè)循環(huán)第八頁，共23頁。（1）PCR緩沖液含50mmol/LKCl及Tris-HCl（pH8.3）（2）MgCl2二價(jià)陽離子對(duì)于酶活性是必須的，Mg2+優(yōu)于Mn2+，而Ca2+無效。Mg2+的最佳濃度相當(dāng)?shù)停ㄒ话?.5mmol/L），且模板DNA中的EDTA及dNTPs中的負(fù)電離子基團(tuán)——磷酸根等都會(huì)影響到Mg2+的有效濃度。在開始新的PCR組合時(shí)，可在0.05mmol/L~5mmol/L之間，設(shè)0.5mmol/L的梯度，進(jìn)行PCR，來摸索最佳Mg2+濃度。

Mg2+濃度對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和產(chǎn)量有著顯著影響。濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。3、一個(gè)典型反應(yīng)的反應(yīng)體系及程序參數(shù)介紹第九頁，共23頁。（3）dNTPs（四種脫氧核糖核苷三磷酸）每種dNTP的終濃度為50-200μmol/L，一般在飽和濃度下使用，即每種200μmol/L。（4）模板DNA閉環(huán)靶序列DNA的擴(kuò)增效率略低于線狀DNA。對(duì)哺乳動(dòng)物基因組DNA擴(kuò)增，每次反應(yīng)約需1~0.1μg，對(duì)于細(xì)菌或質(zhì)粒DNA，僅為pg（10-12g）到ng（10-9g），還可以直接以細(xì)胞為模板。第十頁，共23頁。4、DNA聚合酶（1）Taq酶TaqDNA聚合酶是于1986年從一種生活在75℃熱泉中的棲熱水生菌中分離純化出來，具有3個(gè)重要的特性：

耐高溫最適溫度是72℃，連續(xù)保溫30min，仍具有相當(dāng)?shù)幕钚?，且在比較寬的溫度范圍內(nèi)都保持著催化DNA合成的能力。具有腺嘌呤脫氧核苷三磷酸末端轉(zhuǎn)移酶活性使擴(kuò)增的DNA的3’端多帶上一個(gè)“A”，有利于進(jìn)行TA克隆。在體外，失去3’—5’方向外切酶校正活性，有參錯(cuò)情況出現(xiàn)。在一次典型的PCR反應(yīng)中，其參錯(cuò)率約為1/2*104核苷酸，在體內(nèi)是1/109核苷酸。第十一頁，共23頁。（2）高保真酶但沒有腺嘌呤脫氧核苷三磷酸末端轉(zhuǎn)移酶活性，引物需要設(shè)計(jì)限制性酶切位點(diǎn)，以便后續(xù)的克隆。（3）酶量控制根據(jù)片段長短，循環(huán)數(shù)多少。并非越多越好，加酶過多，會(huì)導(dǎo)致非靶序列擴(kuò)增。在其他參數(shù)最佳時(shí)，每100μl反應(yīng)液中含1-2.5uTaqDNa酶。酶濃度太高，會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，而過低時(shí)，則擴(kuò)增產(chǎn)量太低。

第十二頁，共23頁。5、寡核苷酸引物的設(shè)計(jì)引物引物3’5’5’5’基因組*引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。*引物設(shè)計(jì)的主要原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時(shí)盡可能減少非特異性擴(kuò)增。第十三頁，共23頁。引物設(shè)計(jì)關(guān)鍵點(diǎn)與模板的互補(bǔ)及錯(cuò)配情況：應(yīng)有效結(jié)合到目的序列上，盡可能不與其他部位結(jié)合。且兩引物的結(jié)合位點(diǎn)之間一般為1~2kb，超過3kb擴(kuò)增效率大大降低。3’端要求完全互補(bǔ)，尤其3‘端最后5~6個(gè)核苷酸的錯(cuò)配應(yīng)盡可能的少。一般5’端可以添加一些限制性酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基，不會(huì)影響引物特異序列的退火。引物長度：一般為20~30個(gè)堿基長，最低不能少于16個(gè)。引物太短很可能會(huì)同非靶序列雜交，得到非預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物。一般每增加一個(gè)核苷酸，引物特異性提高4倍。但不能太長，太長增加成本，且引物同模板DNA的雜交速率下降，影響PCR反應(yīng)效率。引物序列：盡量使其GC含量為50%左右，避免出現(xiàn)多個(gè)嘌呤或嘧啶，以防止形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免出現(xiàn)連續(xù)4個(gè)以上同一個(gè)堿基。3’端應(yīng)選用AT，少用GC，可提高引發(fā)效率，避免假引發(fā)。第十四頁，共23頁。引物二聚體：特別要注意引物之間不能互補(bǔ)，尤其在3’末端，否則，就會(huì)發(fā)生退火，出現(xiàn)引物二聚體的擴(kuò)增，與天然模板之間產(chǎn)生競爭的PCR狀態(tài)，從而影響擴(kuò)增成功。若一個(gè)反應(yīng)中加入多對(duì)引物，應(yīng)將其進(jìn)行交叉配對(duì)檢驗(yàn)，若仍有二聚體出現(xiàn)，則改變Mg2+濃度，可降低其含量。引物Tm值：15~25nt時(shí)，Tm=4℃*（G+C）+2℃*（A+T），大于25nt，則要考慮熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)，可用軟件計(jì)算。兩條引物的Tm應(yīng)盡可能相等或相近，最好相差不超過3℃。退火溫度決定于Tm值，它影響引物與模板的結(jié)合效率。引物容易結(jié)合到模板上的溫度是Tm減15℃~25℃，但退火溫度太低會(huì)導(dǎo)致特異性喪失。在Tm值允許的范圍內(nèi)，選擇較高的溫度，可大大減少引物和模板之間的非特異性結(jié)合，從而提高PCR的特異性。所以為了兼顧引物結(jié)合效率和擴(kuò)增特異性，人們采用的退火溫度為Tm減5~15℃。

引物濃度：通常1μmol/L足以完成30個(gè)循環(huán)，濃度過高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增或引物二聚體擴(kuò)增，濃度不足則會(huì)降低PCR效率。第十五頁，共23頁。二、實(shí)驗(yàn)材料l、儀器和材料PCR擴(kuò)增儀，臺(tái)式高速離心機(jī)，Ep管(0.2mL)，微量取液器，20μL和200μL吸頭2、試劑(1)TaqDNA聚合酶(5U/μL)(2)dNTPs混合液(3)引物DNAP1:5’>CTAGTGACATATGAACAGGCGAGACTTCCTGGTCA<3’35ntTm=67℃（NdeI）P2:5’>CCAGCTCGAGTCATGCGACCTCCACCCAGGTCTTC<3’35ntTm=73℃(XhoI)(4)模板DNA:含有1500bp目標(biāo)基因的質(zhì)粒第十六頁，共23頁。三、實(shí)驗(yàn)步驟1、PCR反應(yīng)擴(kuò)增目標(biāo)片段（1）PCR循環(huán)儀預(yù)熱（2）按以下反應(yīng)體系，將各成分在一個(gè)滅菌的0.2mLEp管內(nèi)混合：反應(yīng)體系：反應(yīng)物終濃度

所加體積

10×buffer2μL

2μL

4×dNTP(1mM)800μM

2μL

MgCl2(25mM)1.25mmol/LDNA聚合酶

1U0.2μL上游引物P1

400pmol/L1μL下游引物

P2400pmol/L1μL模板ＤＮＡ(20ng)0.3μL

補(bǔ)水至總體積20μl20μL用手指在管壁上輕彈幾下，混勻上述反應(yīng)混合物，高速離心機(jī)離心10s，使反應(yīng)液集中在管底。第十七頁，共23頁。（3）待PCR儀預(yù)熱后，將上述反應(yīng)混合液放于PCR儀的小池中。（4）按以下程序輸入擴(kuò)增儀，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)：溫度

時(shí)間

９4℃

5min９4℃

30s59℃30s72℃

1min30s72℃

10min

4℃

hold30個(gè)循環(huán)第十八頁，共23頁。2、擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測（1）用TBE配置1%的瓊脂糖凝膠；（2）每人以自提質(zhì)粒為模板，各做20ulPCR體系。反應(yīng)結(jié)束后，在PCR反應(yīng)小管中加入2.5μL10*loadingbuffer，混勻，取3.5uL小孔上樣檢測，剩下的量兩人合并大孔上樣電泳，用于后續(xù)回收。70