基因表達(dá)譜研究技術(shù)發(fā)展與其在農(nóng)業(yè)科學(xué)中應(yīng)用

基因表達(dá)譜研究技術(shù)發(fā)展與其在農(nóng)業(yè)科學(xué)中應(yīng)用第一頁(yè)，共48頁(yè)。目錄1mRNA差異顯示技術(shù)2抑制消減雜交技術(shù)3cDNA-AFLP技術(shù)4基因表達(dá)系列分析技術(shù)5微陣列技術(shù)第二頁(yè)，共48頁(yè)。1mRNA差異顯示技術(shù)

一、概述：mRNA差異顯示技術(shù)

二、DDRT-PCR的發(fā)明及其基礎(chǔ)

三、mRNA差異顯示技術(shù)的原理

四、DDRT-PCR目前的應(yīng)用領(lǐng)域五、DDRT-PCR一般操作步驟

六、DDRT-PCR的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)第三頁(yè)，共48頁(yè)。一、mRNA差異顯示技術(shù)的概述mRNA差異顯示技術(shù)(mRNAdifferentialdisplayPCR,mRNADD-PCR)是由PengLiang等人在1992年建立的篩選基因差異表達(dá)的有效方法。它是將mRNA逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)和PCR技術(shù)相結(jié)合的一種RNA指紋圖譜技術(shù)。每一種組織細(xì)胞(包括同一組織細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同的處理)都有其特異表達(dá)的不同于其他組織細(xì)胞的基因譜，即特異的RNA指紋圖譜。第四頁(yè)，共48頁(yè)。二.DDRT-PCR的發(fā)明及其基礎(chǔ)由Liang于1992年創(chuàng)立是分離差異表達(dá)基因強(qiáng)有力的工具在隨后幾年里，Liang等在技術(shù)方面做了大量改進(jìn)，使技術(shù)更適用、更簡(jiǎn)便基于RT-PCR理論，依賴(lài)于3種技術(shù)1）RT-PCR技術(shù)2）以特定引物進(jìn)行的PCR技術(shù)3）DNA電泳技術(shù)第五頁(yè)，共48頁(yè)。三、mRNA差異顯示技術(shù)的原理：

mRNA差異顯示技術(shù)的主要原理是利用cDNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù),PCR擴(kuò)增和高分辨率聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，來(lái)顯示PCR產(chǎn)物的差異。第六頁(yè)，共48頁(yè)。5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(A)RNA5’T12MN3’錨定引物逆轉(zhuǎn)錄5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’變性5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’退火5‘T12MN3’錨定引物寡核苷酸隨機(jī)引物3‘MNTTTTTTTTTTTT5’延長(zhǎng)dNTP、Taq聚合酶3‘MNTTTTTTTTTTTT5’5’M’N’AAAAAAAAAAA3’變性、退火、延伸電泳顯示T12MN(M為A、G、C，N為A、T、G、C)

啟動(dòng)cDNA第一鏈合成不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物回收差異條帶，再擴(kuò)增，克隆測(cè)序，同源比對(duì)隨機(jī)結(jié)合到cDNA鏈上第七頁(yè)，共48頁(yè)。四.DDRT-PCR目前的應(yīng)用領(lǐng)域基因表達(dá)差異基因的鑒定與克隆抗逆性機(jī)理的研究探究激素調(diào)控機(jī)理第八頁(yè)，共48頁(yè)。五.DDRT-PCR一般操作步驟總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄RT-PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳及差異DNA條帶的回收PCR在擴(kuò)增及其產(chǎn)物的回收測(cè)序和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析實(shí)時(shí)定量PCR第九頁(yè)，共48頁(yè)。mRNA差異顯示技術(shù)簡(jiǎn)略流程圖第十頁(yè)，共48頁(yè)。六.DDRT-PCR的優(yōu)點(diǎn)以RT-PCR和DNA凝膠電泳為基礎(chǔ)靈敏度高，僅需0.2μg的總RNA可以同時(shí)比較多個(gè)樣品間基因表達(dá)的差異可以同時(shí)檢測(cè)到“上調(diào)”及“下調(diào)”的基因時(shí)間短，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可步步驗(yàn)證比較可進(jìn)行多基因家族的表達(dá)分析第十一頁(yè)，共48頁(yè)。

七.DDRT-PCR的缺點(diǎn)假陽(yáng)性高

絕大多數(shù)差異條帶僅含有3’-UTR500bp以?xún)?nèi)的一短片段的信息，這些區(qū)域的序列結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，得不到特異的基因?qū)Φ拓S度mRNA檢出率低第十二頁(yè)，共48頁(yè)。2抑制消減雜交技術(shù)一、概述：抑制消減雜交技術(shù)二、SSH的發(fā)明及其基礎(chǔ)三、抑制消減雜交技術(shù)的原理四、SSH目前的應(yīng)用領(lǐng)域五、SSH一般操作步驟六、SSH的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)第十三頁(yè)，共48頁(yè)。一、抑制消減雜交技術(shù)的概述

抑制消減雜交技術(shù)（suppressionsubtractivehybridization,SSH）技術(shù)是由Diatchenko等于1996年以mRNA差異顯示技術(shù)為基礎(chǔ)建立的篩選未知差異表達(dá)基因的新技術(shù)。它主要基于最近出現(xiàn)的抑制PCR，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化（normalization或equalization）和消減雜交。第十四頁(yè)，共48頁(yè)。二.SSH的發(fā)明及其基礎(chǔ)由Diatchenko于1996年創(chuàng)立是鑒定、分離組織細(xì)胞中選擇性表達(dá)基因的技術(shù)基于RT-PCR理論，依賴(lài)于3種技術(shù)1）RT-PCR技術(shù)2）以特定引物進(jìn)行的PCR技術(shù)3）酶切技術(shù)

第十五頁(yè)，共48頁(yè)。三、抑制消減雜交技術(shù)的原理：

抑制消減雜交技術(shù)原理是以抑制性多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）反應(yīng)為基礎(chǔ)的cDNA消減雜交技術(shù)。通過(guò)合成兩個(gè)不同的接頭,連接于測(cè)試cDNA片段的5’末端,達(dá)到選擇性擴(kuò)增差異性表達(dá)的cDNA片段,抑制非目的cDNA的擴(kuò)增的目的。第十六頁(yè)，共48頁(yè)。四.SSH目前的應(yīng)用領(lǐng)域主要用于疾病研究及動(dòng)物發(fā)育中的應(yīng)用植物基因的分離微生物技術(shù)的應(yīng)用第十七頁(yè)，共48頁(yè)。五.SSH一般操作步驟由RNA合成cDNARsaI限制性?xún)?nèi)切酶酶切cDNA末端接頭連接第一、二次消減雜交末端補(bǔ)齊第一、二次PCR擴(kuò)增富集差異表達(dá)基因第十八頁(yè)，共48頁(yè)。第十九頁(yè)，共48頁(yè)。六.SSH的優(yōu)點(diǎn)該方法的最大優(yōu)點(diǎn)是降低了假陽(yáng)性率SSH方法具有高度敏感性降低了起始樣品的使用量具有較高的檢測(cè)效率和克隆效率

具有背景低、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)程序相對(duì)簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便易行第二十頁(yè)，共48頁(yè)。

七.SSH的缺點(diǎn)SSH技術(shù)需要較多的起始材料且更多地依賴(lài)于PCR技術(shù)消減庫(kù)中的cDNA經(jīng)過(guò)Rsal等限制酶消化后，不再是全長(zhǎng)cDNA不能同時(shí)對(duì)數(shù)個(gè)材料之間進(jìn)行比較,材料之間存在過(guò)多的差異及小片段缺失也不能有效被檢測(cè)完全無(wú)酶切位點(diǎn)的片段或酶切位點(diǎn)較少的基因組無(wú)法用SSH技術(shù)篩選第二十一頁(yè)，共48頁(yè)。3cDNA-AFLP技術(shù)

一、概述：cDNA-AFLP技術(shù)

二、cDNA-AFLP的發(fā)明及其基礎(chǔ)

三、cDNA-AFLP的原理

四、cDNA-AFLP目前的應(yīng)用領(lǐng)域

五、cDNA-AFLP一般操作步驟

六、cDNA-AFLP的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)第二十二頁(yè)，共48頁(yè)。一、cDNA-AFLP技術(shù)的概述cDNA-AFLP是Vos于1995年從基因組AFLP方法發(fā)展來(lái)的一種RNA指紋技術(shù)。第二十三頁(yè)，共48頁(yè)。二.cDNA-AFLP的發(fā)明及其基礎(chǔ)由Vos于1995年創(chuàng)立是用于RNA指紋分析的方法?；赗T-PCR理論，依賴(lài)于3種技術(shù)1）RT-PCR技術(shù)2）AFLP技術(shù)3）電泳技術(shù)第二十四頁(yè)，共48頁(yè)。三、cDNA-AFLP的原理：

以純化的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用識(shí)別序列分別為6-bp和4-bp的兩種限制性?xún)?nèi)切酶酶切雙鏈cDNA，酶切片段與人工接頭連接后，利用與接頭序列互補(bǔ)的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示．第二十五頁(yè)，共48頁(yè)。四.cDNA-AFLP目前的應(yīng)用領(lǐng)域主要用于RNA指紋分析等領(lǐng)域鑒定未知基因分離特異表達(dá)基因基因表達(dá)特征的研究第二十六頁(yè)，共48頁(yè)。五.cDNA-AFLP一般操作步驟模板的制備和cDNA的合成雙鏈cDNA片段的酶切和人工接頭的連接酶切片段的預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增凝膠電泳分析第二十七頁(yè)，共48頁(yè)。第二十八頁(yè)，共48頁(yè)。六.cDNA-AFLP的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)反應(yīng)條件嚴(yán)謹(jǐn),可靠性高,重復(fù)性好不需要預(yù)先知道序列信息所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單優(yōu)點(diǎn)

cDNA-AFLP技術(shù)優(yōu)點(diǎn)眾多較為完善，但仍應(yīng)注意的是內(nèi)切酶（罕見(jiàn)切割酶，常見(jiàn)切割酶）和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析。缺點(diǎn)第二十九頁(yè)，共48頁(yè)。4基因表達(dá)系列分析技術(shù)一、概述：SAGE技術(shù)二、SAGE的發(fā)明及其基礎(chǔ)三、SAGE的原理四、SAGE目前的應(yīng)用領(lǐng)域五、SAGE一般操作步驟六、SAGE的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)第三十頁(yè)，共48頁(yè)。

一、基因表達(dá)系列分析技術(shù)的概述

基因表達(dá)系列分析技術(shù)（serialanalysisofgeneexpression,SAGE）是1995年由Veleulescu等建立的一種新的基因表達(dá)模式研究技術(shù)，它可以在整體水平上對(duì)細(xì)胞或組織中的大量轉(zhuǎn)錄本同時(shí)進(jìn)行定量分析，而無(wú)論其是否為已知基因。第三十一頁(yè)，共48頁(yè)。二.SAGE的發(fā)明及其基礎(chǔ)由Veleulescu于1995年創(chuàng)立SAGE是一種快速分析基因表達(dá)信息的技術(shù)?；赗T-PCR理論，依賴(lài)于3種技術(shù)1）RT-PCR技術(shù)2）DNA測(cè)序技術(shù)3）酶切技術(shù)第三十二頁(yè)，共48頁(yè)。三、SAGE的原理：

9—10bp短標(biāo)簽(tag)是從一個(gè)轉(zhuǎn)錄本內(nèi)分離得到，充分含有識(shí)別轉(zhuǎn)錄本的信息，因?yàn)?0bp(410)從理論上說(shuō)已足夠代表任何一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但其前提是假設(shè)生物體內(nèi)的堿基序列是隨機(jī)分布的；連接多個(gè)短標(biāo)簽，就能把多個(gè)tag集中到一個(gè)克隆中進(jìn)行測(cè)序。第三十三頁(yè)，共48頁(yè)。四.SAGE目前的應(yīng)用領(lǐng)域快速分析基因表達(dá)信息轉(zhuǎn)錄圖譜的構(gòu)建發(fā)現(xiàn)新基因和基因的新功能第三十四頁(yè)，共48頁(yè)。五.SAGE一般操作步驟生物體特定階段組織或細(xì)胞中全部mRNA的制備雙鏈cDNA片段的酶切和人工接頭的連接cDNA的雙鏈的合成

錨定酶酶切cDNA片段與接頭（Linker）的連接標(biāo)簽酶酶切釋放標(biāo)簽序列連接形成雙標(biāo)簽（Ditages）第三十五頁(yè)，共48頁(yè)。第三十六頁(yè)，共48頁(yè)。六.SAGE的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)任何具備PCR和手動(dòng)測(cè)序器具的實(shí)驗(yàn)室都能使用這項(xiàng)技術(shù)結(jié)合自動(dòng)測(cè)序技術(shù)能夠在3個(gè)小時(shí)內(nèi)完成1000個(gè)轉(zhuǎn)錄物的分析可以使用不同的錨定酶，更具靈活性?xún)?yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)

SAGE需要進(jìn)行大量測(cè)序反應(yīng)，費(fèi)用昂貴。第三十七頁(yè)，共48頁(yè)。5微陣列技術(shù)一、概述：微陣列技術(shù)二、微陣列的發(fā)明及其基礎(chǔ)三、微陣列的原理四、微陣列目前的應(yīng)用領(lǐng)域五、微陣列一般操作步驟六、微陣列的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)第三十八頁(yè)，共48頁(yè)。一、微陣列技術(shù)的概述

微陣列(Microarray)技術(shù)主要是指由成千上萬(wàn)個(gè)DNA樣品或寡核昔酸,密集排列于硅片玻片塑料等固相支持物上,再與模板在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交,最后由激光共聚焦顯微鏡等設(shè)備獲取圖象信息,通過(guò)計(jì)算機(jī)分析處理獲得信息的技術(shù)集合。第三十九頁(yè)，共48頁(yè)。二.微陣列的發(fā)明及其基礎(chǔ)由Fodor等人于1991年首先提出DNA芯片的概念是人類(lèi)基因組計(jì)劃（HumanGeneomeProject，HGP）的逐步實(shí)施和分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展及運(yùn)用的產(chǎn)物。基于多種技術(shù)1）Southern雜交技術(shù)2）斑點(diǎn)雜交技術(shù)3）融微電子學(xué)、生命科學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和光電化學(xué)為一體第四十頁(yè)，共48頁(yè)。三、微陣列的原理：

微陣列是指在大規(guī)模集成電路所控制的機(jī)器人在尼龍膜或硅片固相支持物表面，有規(guī)律地合成成千上萬(wàn)個(gè)代表不同基因的寡核苷酸“探針”。這些“探針”可與用放射標(biāo)記物如32P或熒光物如熒光素、麗絲胺等標(biāo)記的目的材料中的DNA或cDNA互補(bǔ)核酸序列相結(jié)合，通過(guò)放射自顯影或激光共聚焦顯微鏡掃描后，對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行計(jì)算機(jī)軟件處理分析，獲得雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布模式圖，以此反映目的材料中有關(guān)基因表達(dá)強(qiáng)弱的表達(dá)譜.第四十一頁(yè)，共48頁(yè)。四.微陣列目前的應(yīng)用領(lǐng)域檢測(cè)基因表達(dá)水平及識(shí)別基因序列檢測(cè)表達(dá)狀況，發(fā)現(xiàn)新基因檢測(cè)突變和多態(tài)性進(jìn)行遺傳作圖DNA序列分析藥物研發(fā)第四十二頁(yè)，共48頁(yè)。五.微陣列