革蘭氏染色及油鏡的使用課件

一目的要求：1、學習并初步掌握革蘭氏染色法。2、了解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性。3、掌握油鏡原理及使用方法。二基本原理：革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家ChristainGran創(chuàng)立的，基本步驟是：1、初染：結(jié)晶紫染色2、媒染：碘液媒染3、脫色：乙醇脫色4、復染：番紅復染實驗一革蘭氏染色及油鏡的使用

經(jīng)此法染色后，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；細胞中初染劑被脫色劑洗脫而染上復染劑的顏色（紅色）的細菌為革蘭氏陰性菌。GramstainofGram-GramstainofGram+細菌對革蘭氏染色的不同反應是由于它們細胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。初染后，所有細菌都被染成初染劑的藍紫色。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫—碘的復合物，增強染料與細菌的結(jié)合力。當用脫色劑處理時，革蘭氏陽性菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇脫色時細胞壁脫水，使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔經(jīng)縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫—碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復染后仍保留初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細胞壁肽聚糖層較薄、類脂質(zhì)含量高，所以當脫色處理時，類脂質(zhì)被乙醇溶解，細胞壁透性增大，使結(jié)晶紫—碘的復合物比較容易被洗脫出來，用復染劑復染后，細胞被染上復染劑的紅色。油鏡原理及說明微生物是個體微小、結(jié)構(gòu)簡單、肉眼無法看到的微小生命體。因此，我們要借助顯微鏡來進行觀察。顯微鏡的種類很多，但基本構(gòu)造可分為兩大部分：一是機械裝置，二是光學系統(tǒng)。（下面以普通光學顯微鏡為例）。1、機械裝置由鏡座、鏡臂、鏡筒與物鏡轉(zhuǎn)移器、載物臺、移動器粗細調(diào)節(jié)器組成。2光學系統(tǒng)由目鏡、物鏡、聚光鏡、反光鏡、光圈組成。（1）目鏡：裝在鏡筒的上端，一般各有8x、10x、15x、16x等種不同的放大倍數(shù)的目鏡。目鏡只能把物鏡成的像再次放大，沒有辨析能力。（2）物鏡：顯微鏡的物鏡是由一組特殊的透鏡組成。一般有低倍鏡（10x）、高倍鏡（40x）和油鏡（100x），它們各有一定的放大率，不僅可以放大標本，而且有辨析能力。低倍鏡：它的視野的實際范圍最大，易于發(fā)現(xiàn)目標，但不易看清微生物個體的形態(tài)。高倍鏡：高倍鏡視野的實際范圍較低倍鏡小些?？梢钥辞鍌€體較大的微生物個體或菌絲體形態(tài)，但個體較小的微生物以及其內(nèi)含物和特殊結(jié)構(gòu)也無法辨清。油鏡：一般在鏡頭上有黑圈或紅圈表示的為油鏡物鏡，也有的以“Oil”字樣表示，油鏡的鏡面很小，工作距離很近。使用時，在載玻片和油鏡物鏡之間加上一滴油（常用香柏油）（而使用低倍、高倍鏡時，是隔以空氣）。當光線通過載玻片時，由于玻璃與香柏油的折射率相近，可直接通過香柏油進入物鏡而不發(fā)生折射，這樣就可以增加照明度，是鏡檢物清晰（參見表1）。表1光線通過幾種介質(zhì)的折射率（n）比較：介質(zhì)空氣水石蠟油香柏油玻璃折射率1.01.331.471.5151.523、鏡檢：干燥后，油鏡觀察。以分散開的細菌顏色為準，革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。4、混合制片觀察：一載玻片上兩種菌混合制片，對比觀察。五、實驗報告：1、結(jié)果：列表簡述2株細菌的染色觀察結(jié)果（形狀、顏色、革蘭氏染色反應）。2、思考題：1）作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚？其染色成敗的關(guān)鍵步驟是什么？2）當你對一株未知菌進行革蘭氏染色時，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？操作步驟涂片