Lowrys法Folin-酚試劑法課件

Lowry’s法（Folin-酚試劑法）測(cè)定蛋白質(zhì)含量DeterminationofproteincontentbyLowry‘smethod怎樣測(cè)定血清中蛋白質(zhì)的含量蛋白質(zhì)含量測(cè)定的常用方法比較方法靈敏度優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)凱氏定氮法0.2~1.0mg氮干擾少，準(zhǔn)確操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)紫外吸收法50～100mg快速簡(jiǎn)便無(wú)損樣品靈敏度低干擾物較多考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）法1～5ug靈敏、簡(jiǎn)便、快速不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差雙縮脲法1～20mg干擾相對(duì)少，較快靈敏度低Lowry法20～250ug靈敏度高干擾物質(zhì)多、費(fèi)時(shí)、操作嚴(yán)格計(jì)時(shí)蛋白質(zhì)含量測(cè)定的常用方法比較方法靈敏度優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)凱氏定氮法0.2~1.0mg氮干擾少，準(zhǔn)確操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)紫外吸收法50～100mg快速簡(jiǎn)便無(wú)損樣品靈敏度低干擾物較多考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）法1～5ug靈敏、簡(jiǎn)便、快速不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差雙縮脲法1～20mg干擾相對(duì)少，較快靈敏度低Lowry法20～250ug靈敏度高干擾物質(zhì)多、費(fèi)時(shí)、操作嚴(yán)格計(jì)時(shí)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握Folin-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理及其實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)。2、掌握制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的要領(lǐng)和通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品溶液中待測(cè)定物質(zhì)含量的方法。原理1921年，F(xiàn)olin首創(chuàng)，利用蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚基）還原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍(lán)色反應(yīng)。1951年，Lowry對(duì)此法進(jìn)行了改進(jìn)，先于標(biāo)本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應(yīng)，提高了靈敏度。原理第一步：雙縮脲反應(yīng)

在堿性溶液中,雙縮脲(H2NOC－NH－CONH2)能與Cu2+作用,形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物,這個(gè)反應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的多個(gè)肽鍵,因此有雙縮脲反應(yīng)。即在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu2+作用生成紫紅色的蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物。在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比色即可求出蛋白質(zhì)的含量。即根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中蛋白質(zhì)的含量。原理樣品健康人血清正常人血清蛋白質(zhì)含量：60~80g/L儀器和器材1、722型分光光度計(jì)2、恒溫水浴箱3、試管6支、試管架4、加樣槍、加樣槍架5、坐標(biāo)紙操作試劑（ml)123456牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液-0.200.400.600.80-樣品液（稀釋300倍）-----0.50蒸餾水1.00.800.600.400.200.50堿性硫酸銅2.02.02.02.02.02.0各管混勻，室溫放置10min。向各管內(nèi)加入Folin-酚試劑0.20mL,2s內(nèi)迅速混勻！40℃放置10min。冷卻至室溫后，以500nm波長(zhǎng)比色，用1號(hào)管作空白，讀取各管吸光度。蛋白質(zhì)濃度（μg/ml）04080120160未知注意事項(xiàng)Folin-酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而堿性硫酸銅試劑是在堿性條件下與蛋白質(zhì)作用生成堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液。故當(dāng)Folin-酚試劑加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中后，必須立即混勻（加一管混勻一管），使還原反應(yīng)發(fā)生在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前。

數(shù)據(jù)處理

2345測(cè)定次數(shù)1236各管平均A值各管A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟1、選擇合適的坐標(biāo)紙2、畫(huà)坐標(biāo)軸3、根據(jù)測(cè)得的數(shù)據(jù)描點(diǎn)4、連線5、求實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以A500值為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，用鉛筆繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸光度A蛋白質(zhì)濃度C（μg/ml）0.20.40.6....4080120160計(jì)算根據(jù)未知樣品溶液的吸光度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量。然后乘以稀釋倍數(shù)（300），得出每毫升未稀釋血清含蛋白質(zhì)的微克數(shù)，即每毫升血清中蛋白質(zhì)的微克數(shù)(μg/ml)。血清蛋白濃度(μg/ml)=樣品蛋白質(zhì)濃度×2×300本方法的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1.靈敏度高，比雙縮脲法靈敏約100倍。2.操作簡(jiǎn)單，不需特殊儀器設(shè)備。缺點(diǎn)：1.費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間2.標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式3.專一性較差，干擾物質(zhì)較多。

722型分光光度計(jì)操作步驟1.靈敏度旋鈕調(diào)至”1”檔,選擇開(kāi)關(guān)置于”T”,旋轉(zhuǎn)波長(zhǎng)調(diào)節(jié)旋鈕(λ)至所需波長(zhǎng);2.接通電源,打開(kāi)電源開(kāi)關(guān),預(yù)熱5~10分鐘;3.打開(kāi)樣品室蓋,調(diào)節(jié)旋鈕”0”,使透光度(T)讀數(shù)為0;4.裝有空白溶液和待測(cè)試樣溶液的比色杯依次入比色槽架中,置入樣品室;5.拉動(dòng)比色架拉桿,裝空白溶液的比色杯移入光路中,蓋上樣品室蓋,調(diào)節(jié)旋鈕”100”,使透光度(T)讀數(shù)為100.若達(dá)不到100,可適當(dāng)增加靈敏