PCR技術(shù)講座課件

PCR技術(shù)及其應(yīng)用

謹(jǐn)以此與零點(diǎn)的朋友們交流學(xué)習(xí)ContentsPCR原理及其分類(lèi)1常規(guī)PCR體系配制與程序設(shè)置2不同PCR引物設(shè)計(jì)原則3PCR:（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在體外模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的環(huán)境配制適當(dāng)?shù)木彌_體系然后加入各種組分:模板DNA，四種核苷酸，Mg2+,DNA聚合酶，上下游引物，通過(guò)高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán)來(lái)擴(kuò)增模板DNA。每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過(guò)30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬(wàn)倍;擴(kuò)增了特異區(qū)段的DNA帶。

PCR基本原理1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍1）不對(duì)稱(chēng)PCR目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱(chēng)為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對(duì)量。用途：制備核酸序列測(cè)定的模板制備雜交探針基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究

高濃度引物低濃度引物2)反向PCR(reversePCR)是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增?？蓪?duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫(kù)的插入DNA；建立基因組步移文庫(kù)。已知序列未知序列未知序列3）多重PCR用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。電泳引物4）LP-PCR（Labelledprimers)

利用同位素、熒光素等對(duì)ＰＣＲ引物進(jìn)行標(biāo)記，用以直觀(guān)地檢測(cè)目的基因。特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷可同時(shí)檢測(cè)多種基因成分病毒1病毒2病毒3病毒45）錨式PCR已知靶基因片段兩測(cè)的序列6）原位ＰＣＲ原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（InStillPCR，Is－PCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來(lái)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段，在不破壞細(xì)胞的前提下，利用一些特定的檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增。可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。適用于檢測(cè)病理切片中含量較少的靶序列

原位PCR的作用

既往鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ISH），但在每個(gè)細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下，該方法的敏感度就明顯下降。而標(biāo)準(zhǔn)的PCR則可擴(kuò)增出細(xì)胞內(nèi)單拷貝的序列，敏感度很高，但卻未能與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合。ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來(lái)，成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測(cè)技術(shù)。利用該法可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測(cè)細(xì)胞的潛在感染方面也具有重要意義。基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈8)熒光定量PCRcDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapidamplificationofcDNAends,RACE)是一種基于PCR從低豐度的轉(zhuǎn)錄本中快速擴(kuò)增cDNA的5‘和3’末端的有效方法。經(jīng)典的RACE技術(shù)是由Frohman等(1988)發(fā)明的一項(xiàng)技術(shù)，主要通過(guò)RT-PCR技術(shù)由已知部分cDNA序列來(lái)得到完整的cDNA5’和3’端，包括單邊PCR和錨定PCR9）RACE技術(shù)巢式PCR（nestedPCR），是指利用兩套PCR引物（巢式引物）對(duì)進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

在第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。

由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴(kuò)增，從而降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性（因?yàn)榕c兩套引物都互補(bǔ)的引物很少）增加了檢測(cè)的敏感性；又有兩對(duì)PCR引物與檢測(cè)模板的配對(duì)，增加了檢測(cè)的可靠性。10)巢式PCRPCR體系配制與程序設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L上下游引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L1）PCRbuffer:500mMKCl,100mMTris-HCl(pH9.0，25℃),1%TritonX-100主要是為反應(yīng)提供相應(yīng)的離子環(huán)境和酸堿環(huán)境2）dNTP提供原料3）Mg2+Taq酶反應(yīng)必須二價(jià)陽(yáng)離子4）引物特異識(shí)別靶標(biāo)序列，與模板退火5)模板：質(zhì)粒，cDNA,菌液均可以做模板6）Taq酶熱穩(wěn)定的DNA聚合酶PCR體系各種成分的作用1）模板濃度/體積：一般情況下為了保證PCR效果建議DNA濃度在20ng/ul-100ng左右，特別是以片段和質(zhì)粒作為模板，如以菌液作為模板，OD600以0.4-1為宜，過(guò)高過(guò)低均影響效果。模板的體積不宜超過(guò)總體積的1/10。2）引物體積，由于引物濃度基本恒定，所以只能調(diào)節(jié)引物體積。以cDNA為模板，使用簡(jiǎn)并引物時(shí)體積可加大，但不宜超過(guò)總體積的1/10如果使用特異引物，以質(zhì)?；蚱螢槟０澹矬w積一般控制在總體積的1/20左右。3）Mg2+：Mg2+是DNA聚合酶最重要的的激活劑，在一定濃度范圍內(nèi)升高M(jìn)g2+濃度能促進(jìn)Taq酶的聚合活性。Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降Mg2+過(guò)高影響反應(yīng)特異性。可變因子普通PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)程序：94℃5min94℃30s55℃30s72℃1min30循環(huán)1.

引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)。

DNA序列的保守區(qū)是通過(guò)物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過(guò)序列分析軟件（比如DNAman）比對(duì)（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。2.引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間。引物長(zhǎng)度（primerlength）常用的是18-27bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。GC含量（composition）過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。引物設(shè)計(jì)的一般原則4.引物3′端要避開(kāi)密碼子的第3位。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。

5.引物3′端一般不要選擇AT，一般選擇G或C。引物3′端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成。而由于GC結(jié)合強(qiáng)度大于AT所以最好選擇GC6.堿基要隨機(jī)分布。

引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)（Falsepriming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在GC富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。7.引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。

引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體（Dimer與Crossdimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話(huà)，應(yīng)盡量使其△G值不要過(guò)高（應(yīng)小于4.5kcal/mol）。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。8.引物5′端和中間△G值應(yīng)該相對(duì)較高，而3′端△G值較低?！鱃值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性，△G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5′端和中間△G值相對(duì)較高，而3′端△G值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9）的引物。引物3′端的△G值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。（不同位置的△G值可以用Oligo6軟件進(jìn)行分析）9.引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。

引物的5′端決定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。引物的延伸是從3′端開(kāi)始的，不能進(jìn)行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能。10.擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。某些引物無(wú)效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開(kāi)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件（比如RNAstructure）可以預(yù)測(cè)估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開(kāi)這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。11.引物應(yīng)具有特異性。引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST檢測(cè)。如果與