乳酸脫氫酶法操作說明

LDH法細胞毒性檢測:原理：乳酸脫氫酶在胞漿內(nèi)含量豐富，正常時不能通過細胞膜，當細胞受損或死亡時可釋放到細胞外，所以細胞死亡數(shù)目與細胞培養(yǎng)上清中LDH活性成正比,用比色法測定實驗孔LDH活性,并與靶細胞對照孔進行比較，可計算效應細胞對靶細胞的殺傷百分率LDH（乳酸脫氫酶）是一種極為穩(wěn)定的細胞質(zhì)酶，存在于正常細胞的胞質(zhì)中，一旦細胞膜受損，LDH即被釋放到細胞外；LDH催化乳酸形成丙酮酸鹽，和INT（四唑鹽類）反應轉(zhuǎn)化成紅色甲臆化合物，可通過酶標儀進行檢測。顏色形成的量與裂解細胞的數(shù)目成正比。應用一個96-孔平板讀數(shù)計收集可見光波長的吸收值數(shù)據(jù)。這個分析可用于測量在細胞介導的細胞毒性分析中細胞膜的完整性，這種情況下目標細胞被效應細胞裂解，可判斷細胞受損的程度。乳酸脫氫酶（LDH）在胞質(zhì)內(nèi)含量非常豐富，細胞處于正常狀態(tài)下其不能通過細胞膜，但當細胞受到損傷或死亡時便可釋放到細胞外，此時細胞培養(yǎng)液中LDH的活性與細胞的死亡數(shù)目呈正比，通過用比色法測定并與靶細胞對照孔的LDH活性進行比較，可計算出效應細胞對靶細胞的殺傷百分數(shù)。該實驗方法操作簡便、快速，可應用于CTL和NK細胞活性測定及藥物、化學物質(zhì)或放射所引起的細胞毒性，目前已有LDH法測定CTL活性的試劑盒。同時設4個對照:靶細胞最大釋放組、體積校正對照組、背景對照組和自然釋放組按5：1、10：1、20:1（效應細胞：靶細胞）細胞過度生長、密度過高、離心速度過大、培養(yǎng)箱內(nèi)外溫差過大等因素會造成細胞自然釋放乳酸脫氫酶操作流程：設立效應細胞孔（不同濃度的效應細胞設立效應細胞自發(fā)釋放組）：50/效應細胞+50/培養(yǎng)基實驗組：靶細胞不變，改變效應細胞：50gl效應細胞+50gl靶細胞設立靶細胞自發(fā)釋放組：50/靶細胞+50gl培養(yǎng)基設立靶細胞最大釋放組：50gl靶細胞+50gl培養(yǎng)基+10/裂解液（10x）設立體積校正對照組：100/培養(yǎng)基+10gl裂解液（10x）設立背景對照組：100叫培養(yǎng)基250g離心4分鐘37°C孵育4小時離心前45分鐘添加裂解液（10x）至靶細胞最大釋放組250g離心4分鐘取上清50gl轉(zhuǎn)移至另一孔板（可選）于獨立的孔中加50glLDH陽性對照（1：5000）于每孔中添加50gl再次稀釋的底物混合物室溫避光孵育30分鐘添加50gl終止溶液490nm測吸收值靶細胞接種數(shù)目的優(yōu)化設立檢測板準備靶細胞：調(diào)整細胞濃度0,5,000,10,000,20,000/100gl，使用與細胞毒分析相同的培養(yǎng)基及孔板終體積。例如，若以50M/孑L的靶細胞及50ul/孔的效應細胞接種，則以100ul/孔梯度稀釋。設置不含細胞的背景對照組可選:驗證LDH陽性對照。使用渦旋混勻器輕輕混勻LDH陽性對照液，以1：5000稀釋（稀釋方法：取2M原液至10ml的PBS+1%BSA）。使用與實驗孔相同的體積。1.2.細胞裂解及收獲上清裂解細胞每100Ul培養(yǎng)基加10Ul裂解溶液（10x）37°C,5%CO2孵育45分鐘250g離心4分鐘LDH檢測轉(zhuǎn)移50Ul上清至另一孔板解凍檢測緩沖液，取12ml（避光），將剩余的迅速凍存（可以使用37C水浴解凍，但不可放置過長時間）。將12ml檢測緩沖液添加到一瓶底物混合液（可用于兩個96孔板）中，倒置混勻。稀釋后，避光、迅速添加。50ul/孔添加稀釋的底物混合液，室溫避光孵育30分鐘（未使用的稀釋后底物混合物液放于-20C保存6-8周）添加50gl終止溶液將孔中含有的氣泡去除，一小時內(nèi)檢測吸收值（490或492nm）至少檢測兩次吸收值接種靶細胞（100ul^L）至96孔板加入裂解液（或凍存-解凍）250g離心4分鐘取上清50gl轉(zhuǎn)移至另一孔板用檢測緩沖液稀釋底物混合物添加底物混合物50gl/孔室溫避光孵育30分鐘添加50gl終止溶液490nm測吸收值細胞毒分析檢測設立檢測板效應細胞自發(fā)釋放組設立不同濃度的效應細胞自發(fā)釋放組，終體積與實驗孔一致實驗組加入相同數(shù)目的靶細胞，按照不同效靶比加入效應細胞，補足培養(yǎng)基（最小體積:100叫/孔）。靶細胞自發(fā)釋放組加入最優(yōu)化的靶細胞數(shù)，補足終體積靶細胞最大釋放組加入最優(yōu)化的靶細胞數(shù)，補足終體積。體積校正對照組100gl培養(yǎng)基中加入10gl的裂解液，用于校正由于加入裂解液而引起的體積變化（體積改變影響酚紅及血清的含量）。背景對照組用于校正培養(yǎng)基中由酚紅及血清引起的LDH影響。LDH陽性對照（可選）使用渦旋混勻器輕輕混勻LDH陽性對照液，以1：5000稀釋（稀釋方法：取2ul原液至10ml的PBS+1%BSA）。使用與實驗孔相同的體積250g離心4分鐘，以使效應細胞與靶細胞充分接觸2.2.細胞培養(yǎng)、收獲上清2.2.1.37C，5%CO2孵育檢測板（效靶細胞接觸的最短時間為4小時）靶細胞最大釋放組中加入裂解液每100時培養(yǎng)基加10ul裂解溶液（10X）。該體系中TritonX-100的濃度為0.8%，可使靶細胞完全裂解（收獲上清前45分鐘加入裂解溶液）。顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，若靶細胞未完全裂解，再補5ul的裂解液。250g離心4分鐘LDH檢測轉(zhuǎn)移50M上清至另一孔板解凍檢測緩沖液，取12ml（避光），將剩余的迅速凍存（可以使用37°C水浴解凍，但不可放置過長時間）。將12ml檢測緩沖液添加到一瓶底物混合液（可用于兩個96孔板）中，倒置混勻。稀釋后，避光、迅速添加。50ul/孔添加稀釋的底物混合液，室溫避光孵育30分鐘（未使用的稀釋后底物混合物液放于-20C保存6-8周）添加50以終冬止溶液將孔中含有的氣泡去除，一小時內(nèi)檢測吸收值（490或492nm）2.4.結(jié)果統(tǒng)計所有的實驗組、效應細胞自發(fā)釋放組、靶細胞自發(fā)釋放組的吸收值應減去背景平均吸收值靶細胞最大釋放組的吸收值應減去體積校正對照組的平均吸收值校正后的值用于殺傷率的統(tǒng)計：細胞殺傷率（%）=:（實驗組釋放-效應細胞自發(fā)釋放-靶細胞自發(fā)釋放）/（靶細胞最大釋放-靶細胞自發(fā)釋放）］X100%對岫試驗組對岫①敕放到胞白爰LUH辟放眄不同教拒蟲燦應翹胞”總*1/、亳5心、riO^'tOOpD例靶細胞景大LD且祥顯量倒靶餉脂自發(fā)LD1I釋故屈④硼培弄液LDH梓艦易尊Volumet-orrecri-on不同戮呆的效應紙胞＜1-25-10\2.5?!0\S?10\1*10叫購］lL）別和細圍■混合后M入96孔板壽昵心Ein后3TC孵”'4h離心襯加入IOX