生物技術(shù)制藥第5章

生物技術(shù)制藥第5章第1頁/共91頁第一節(jié)概述1665年英國物理學(xué)家虎克用自制的顯微鏡發(fā)現(xiàn)了細胞，實際上是死細胞留下的細胞壁，不久，荷蘭科學(xué)家列文虎克才真正觀察到了細胞。從此認為細胞是一切動植物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單元。1838年德國的植物學(xué)家施萊登和動物學(xué)家施旺共同創(chuàng)立了細胞學(xué)說。第2頁/共91頁細胞學(xué)說所有生物都是由一個或多個細胞組成的；細胞是生命的基本單位；新細胞是由原有細胞分裂而來的。第3頁/共91頁細胞培養(yǎng)是將細胞從機體取出，在體外模擬機體體內(nèi)生理條件進行培養(yǎng)，使之生存和生長。細胞培養(yǎng)已有近百年歷史了。隨著細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)和基因工程等一系列學(xué)科和技術(shù)的發(fā)展，逐漸形成了細胞工程學(xué)。第4頁/共91頁細胞工程是以細胞為單位，按人們的意志，應(yīng)用生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論和技術(shù)，有目的地進行精心操作，使細胞的某些遺傳特性發(fā)生改變，從而達到改良或產(chǎn)生新品種的目的，以及使細胞增加或重新獲得產(chǎn)生某種特定產(chǎn)物的能力，從而在離體條件下進行大量培養(yǎng)、增殖，并提取出對人類有用的產(chǎn)品。第5頁/共91頁第6頁/共91頁第二節(jié)動物細胞的形態(tài)和生理特點一、動物細胞的形態(tài)動物細胞屬于真核細胞，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分化精確，不同細胞執(zhí)行不同的功能，例如神經(jīng)細胞具有很長的分支，很多的纖維，以便接受和傳遞刺激，紅細胞呈扁圓盤狀，增大其接觸面等。但細胞在離體培養(yǎng)時形態(tài)會發(fā)生變化，根據(jù)不同的需要將離體培養(yǎng)的細胞分為三類：貼壁依賴型、貼壁非依賴型和兼性貼壁型。第7頁/共91頁第8頁/共91頁1、貼壁細胞生長時必須要有給以貼附的支持物表面，細胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長和繁殖。第9頁/共91頁第10頁/共91頁細胞在表面上生長時有兩種形態(tài)，成纖維樣細胞型和上皮樣細胞型。成纖維樣細胞型主要來源于中胚層組織細胞，如心肌細胞、平滑肌細胞成骨細胞等。上皮樣細胞型主要來源于外胚層和內(nèi)胚層組織細胞，如皮膚細胞、腸管上皮細胞，在培養(yǎng)過程中，隨著培養(yǎng)條件的變化細胞形態(tài)也會發(fā)生改變。第11頁/共91頁貼壁細胞單層培養(yǎng)的優(yōu)點1、可以很方便地進行完全換液；2、如果需要高細胞密度，可通過灌流技術(shù)完成；3、很多細胞只有在貼壁時才能更有效地表達產(chǎn)物；4、可用于所有細胞類型。第12頁/共91頁細胞貼壁的表面處理可以使用三種物質(zhì)1、玻璃，重復(fù)使用貼壁效果會降低，用1mmol/L醋酸鎂室溫浸泡幾個小時，再用蒸餾水反復(fù)沖洗可恢復(fù)貼壁能力。2、塑料，聚苯乙烯最常用。3、金屬，不銹鋼或鈦，化學(xué)特性呈惰性，具有適合的高陰性電量。第13頁/共91頁單層培養(yǎng)的放大1、轉(zhuǎn)瓶；2、改進的轉(zhuǎn)瓶，玻璃管、增大表面積的轉(zhuǎn)瓶；3、單元操作系統(tǒng)，玻璃珠反應(yīng)器、微載體系統(tǒng)。第14頁/共91頁第15頁/共91頁第16頁/共91頁第17頁/共91頁2、懸浮細胞生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中懸浮生長，如淋巴細胞等。3、兼性貼壁細胞根據(jù)生長條件的不同可貼壁也可懸浮生長，中國地鼠卵巢細胞。第18頁/共91頁第19頁/共91頁二、動物細胞生理特點1、分裂期長12-48小時，同一種屬不同部位的細胞也不相同，分裂期受培養(yǎng)條件的影響如溫度、酸度、成分等。第20頁/共91頁2、細胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象。大多數(shù)二倍體細胞的生長都需在一定的基質(zhì)上貼附，伸展后才能生長繁殖，機制并不清楚，當(dāng)細胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片時，即細胞與周圍細胞接觸時，細胞就停止增殖—接觸抑制，若細胞轉(zhuǎn)化成異倍體后，該抑制可解除。第21頁/共91頁3、正常二倍體細胞的壽命是有限的。正常二倍體細胞傳代培養(yǎng)都是有限的，大約在50代左右，然后細胞就會逐漸死亡，但在培養(yǎng)基中加入表皮生長因子或經(jīng)自然和人為的因素轉(zhuǎn)為異倍體后該細胞可轉(zhuǎn)變成無限細胞系，更適合于工業(yè)生產(chǎn)。第22頁/共91頁4、動物細胞對周圍環(huán)境十分敏感物理化學(xué)因素，如滲透壓、酸度、離子濃度、剪切力、微量元素等的變化都會影響其生長，這是由于動物細胞沒有細胞壁的保護，所以更敏感。第23頁/共91頁5、動物細胞對培養(yǎng)基要求很高原核生物只要有碳源、氮源和無機鹽就可以生長；而動物細胞不僅需要12種必需氨基酸、8種以上維生素，多種無機鹽和微量元素、葡萄糖外，還需要多種細胞生長因子和貼壁因子。第24頁/共91頁6、動物細胞蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細菌不同。動物細胞蛋白質(zhì)的合成在游離和粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上都可以進行，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的蛋白質(zhì)多數(shù)為糖蛋白，需要糖基化，而細菌細胞則沒有糖基化過程。第25頁/共91頁動物細胞作為宿主細胞生產(chǎn)藥物的優(yōu)點和缺點：優(yōu)點：多半可分泌到細胞外，提取純化方便，蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化修飾后與天然產(chǎn)物更一致，適合于臨床應(yīng)用。缺點：培養(yǎng)條件要求高、成本高、產(chǎn)量低。第26頁/共91頁第三節(jié)生產(chǎn)用動物細胞的要求和獲得一、要求最初要求生產(chǎn)用動物細胞必須是原代細胞，以后放寬至二倍體細胞即可，即使是經(jīng)過多次傳代也可用，但是非二倍體細胞是絕對禁止使用的，因為擔(dān)心異倍體細胞的核酸會影響到人的正常染色體，有致癌的危險。由于二倍體細胞傳代不會超過50代，所以使用受到限制。后來發(fā)現(xiàn)異倍體也可使用，并未對機體產(chǎn)生影響，并且可無限使用，對工業(yè)生產(chǎn)帶來了極大的方便。第27頁/共91頁二、獲得原代細胞、已建立的二倍體細胞系及可無限傳代的轉(zhuǎn)化細胞系。1、原代細胞直接取自動物組織、器官，經(jīng)過粉碎、消化后獲得的細胞懸液。需大量動物，費錢費勞力。第28頁/共91頁2、二倍體細胞原代細胞經(jīng)過傳代、篩選和克隆，從而從多種細胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細胞株。特點：二倍體；有明顯的貼壁和接觸抑制特性；有限的增殖能力；無致瘤性。第29頁/共91頁3、轉(zhuǎn)化細胞系通過轉(zhuǎn)化形成，變成了異倍體，有無限增殖能力。轉(zhuǎn)化可自發(fā)，在傳代過程中自己轉(zhuǎn)變成可無限增殖的細胞；也可人為轉(zhuǎn)化，采用某些試劑處理，或從動物的腫瘤組織中建立的細胞系。優(yōu)點：無限傳代、倍增時間短、對培養(yǎng)條件和生長因子的要求低，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。第30頁/共91頁三、生產(chǎn)常用動物細胞的特性WI-38：人二倍體細胞系，成纖維細胞，能產(chǎn)生膠原，倍增時間為24小時，有限壽命50代，用于制備疫苗。MRC-5：人二倍體細胞系，成纖維細胞，有限壽命42-46代，用于制備疫苗。CHO-K1：從中國地鼠卵巢中分離的上皮樣細胞，用于構(gòu)建工程菌。第31頁/共91頁BHK-21：從地鼠幼鼠的腎臟中分離。成纖維樣細胞，用于構(gòu)建工程菌，可生產(chǎn)疫苗。Vero：從非洲綠猴腎中分離，貼壁依賴的成纖維細胞，用于制備疫苗。Namalwa：從淋巴瘤病人分離，生產(chǎn)干擾素。SP2/0-Ag14：從抗羊紅細胞活性的小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞系融合獲得，生產(chǎn)單克隆抗體。第32頁/共91頁四、基因工程細胞的構(gòu)建和篩選生產(chǎn)中常采用融合細胞或基因工程構(gòu)建的工程細胞。第33頁/共91頁1、真核細胞基因表達載體的構(gòu)建常用病毒或質(zhì)粒載體，用桿狀病毒作載體的優(yōu)點：該病毒基因是雙鏈的容易進行重組；插入7-8千堿基對不影響正常病毒的形成；可用外源基因更換部分病毒基因，仍具有感染力；有很強的啟動子；用光學(xué)顯微鏡可見，容易挑選陽性克隆；可直接表達外源基因。第34頁/共91頁構(gòu)建穿梭質(zhì)粒載體的基本成分：允許載體在細胞內(nèi)擴增的質(zhì)粒序列；含有能使基因轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控元件；能用以篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記；有時還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴增系統(tǒng)。第35頁/共91頁2、載體的導(dǎo)入和高效表達

工程細胞的篩選載體的導(dǎo)入可用融合法、化學(xué)法、物理法、病毒法。最常用磷酸鈣沉淀和電穿孔法。第36頁/共91頁磷酸鈣沉淀法

將溶解的DNA加在磷酸氫二鈉溶液中，再逐漸加入氯化鈣溶液，當(dāng)磷酸氫二鈉和氯化鈣形成磷酸鈣沉淀時，DNA被包裹在當(dāng)中，形成DNA-磷酸鈣共沉淀。當(dāng)沉淀物與細胞表面接觸時，通過細胞吞噬作用將DNA導(dǎo)入其中。優(yōu)點是方法簡單、可進行共轉(zhuǎn)化，可將不含選擇性標(biāo)記的DNA和含選擇性標(biāo)記的DNA放在一起進行形成混合的共沉淀物，一起導(dǎo)入細胞。第37頁/共91頁電穿孔法

借助電穿孔儀產(chǎn)生的高壓脈沖電場，使細胞膜出現(xiàn)瞬時可逆性的小孔，外源DNA即可進入細胞。轉(zhuǎn)化效率較高，但進入的DNA拷貝數(shù)較低。依靠構(gòu)建載體內(nèi)的選擇性標(biāo)記采用相應(yīng)的篩選系統(tǒng)：HAT、GPT、G418、MTX篩選相應(yīng)的轉(zhuǎn)化細胞；對選出的細胞要進行克隆和亞克隆使其純化。第38頁/共91頁五、細胞庫的建立除原代細胞外，其他細胞株、細胞系，包括二倍體、轉(zhuǎn)化細胞、融合細胞和工程細胞都需建立細胞庫保存。用于生產(chǎn)的工程細胞必須建立兩個細胞庫，原始細胞庫和生產(chǎn)用細胞庫。第39頁/共91頁原始細胞庫應(yīng)有詳細檔案：1、該細胞系的歷史：來源、動物的年齡和性別、細胞分離的方法和所用的培養(yǎng)材料。2、該細胞的特性：形態(tài)、生長特性。3、對各種有害因子的檢查結(jié)果，細菌、真菌、支原體和各種病毒。第40頁/共91頁第四節(jié)動物細胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基一、動物細胞在體外培養(yǎng)所需條件1、所有的與細胞接觸的設(shè)備、器材和溶液都必須保持絕對無菌，避免污染；2、必須有足夠的營養(yǎng)保證，絕對不可有有害的物質(zhì)，避免有害離子；第41頁/共91頁3、保證有適量的氧氣供應(yīng)；4、需隨時清除細胞代謝中的有害產(chǎn)物；5、有良好的適于生存的外界環(huán)境，滲透壓、離子濃度和酸度；6、及時分種，保持合適的細胞密度。第42頁/共91頁二、動物培養(yǎng)基的種類和組成天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基第43頁/共91頁血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。1、天然培養(yǎng)基第44頁/共91頁2、合成培養(yǎng)基組成穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)供應(yīng)。成分為氨基酸（細胞合成蛋白質(zhì)的原料）、維生素（維持細胞生命活動的低分子活性物質(zhì)，形成酶的輔基或輔酶）、糖類（碳源）、無機鹽（保持細胞的滲透壓并參與代謝）、其他（前體和氧化還原劑）。第45頁/共91頁合成培養(yǎng)基中除了各種營養(yǎng)成分外，還需添加5%-10%的小牛血清，才能使細胞很好地增殖。第46頁/共91頁添加小牛血清的作用1、提供有利于細胞生長增殖所需的各種生長因子和激素；2、提供有利于細胞貼壁所需的貼附因子和伸展因子；3、提供可識別金屬、激素、維生素和脂類的結(jié)合蛋白；4、提供細胞生長所必需的脂肪酸和微量元素。第47頁/共91頁3、無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基在天然或合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加激素、生長因子、結(jié)合蛋白、貼附和伸展因子及其他元素。第48頁/共91頁無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點優(yōu)點：1、提高了細胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了血清差異所帶來的細胞差異；2、減少了由血清帶來的病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險；3、供應(yīng)充足、穩(wěn)定；細胞產(chǎn)品易于純化；4、避免了血清中某些因素對有些細胞的毒性；5、減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于結(jié)果分析。第49頁/共91頁第五節(jié)動物細胞培養(yǎng)的基本方法一、細胞分離二、細胞計數(shù)三、細胞傳代四、細胞的凍存和復(fù)蘇第50頁/共91頁一、細胞分離1、離心分離法從含有細胞的體液如血液、羊水、腹水中分離細胞。800-1000轉(zhuǎn)/分，離心5-10分。轉(zhuǎn)速過高或時間過長會使細胞損壞或死亡。第51頁/共91頁2、消化分離法先從生物體取來組織塊，將其剪碎，并用消化液將其消化，使組織松散成細胞懸液，然后用緩沖液洗滌，離心，去除殘留的消化液而獲得所需的細胞。常用的消化物：胰蛋白酶、EDTA、胰酶－檸檬酸鹽、胰酶－EDTA等。第52頁/共91頁二、細胞計數(shù)在細胞分離制成懸液準備接種培養(yǎng)前都要對細胞進行計數(shù)，然后按需要量接種于培養(yǎng)瓶或反應(yīng)器中。在觀察細胞增長變化以及藥物對細胞的抑制作用時也常用到計數(shù)。常用方法：自動細胞計數(shù)器血球計數(shù)板計數(shù)結(jié)晶紫染色細胞核計數(shù)

MTT染色計數(shù)法第53頁/共91頁三、細胞傳代當(dāng)細胞增殖到一定程度，由于營養(yǎng)條件、代謝廢物、接觸抑制等限制，需要及時分種，否則細胞會死亡、脫落，所以在培養(yǎng)過程中要及時傳代。懸浮細胞的傳代：將原培養(yǎng)瓶中的細胞懸液分種到幾個裝有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。貼壁細胞的傳代：先消化再分種。第54頁/共91頁四、細胞的凍存和復(fù)蘇凍存為了長期讓細胞存活即保存細胞，常采用液氮低溫凍存（-196℃）。在凍存過程中，滲透壓的改變會影響脂蛋白使細胞膜破裂，可適當(dāng)加入保護劑，如甘油和二甲基亞砜，這些小分子容易滲入到細胞中。在冷凍過程中速度控制很重要，太慢會產(chǎn)生冰晶損傷細胞，太快不足以使水分排出。第55頁/共91頁凍存中應(yīng)注意的事項1、凍存的細胞應(yīng)處在良好的營養(yǎng)狀態(tài)，在凍存前一天要換培養(yǎng)液。2、細胞密度以1*106－2*106個/mL為好。3、凍存用培養(yǎng)基要和實際使用的一致，保護劑也需要除菌。4、分裝安瓿若是玻璃材質(zhì)，需要檢驗其密封性。5、標(biāo)簽上要寫明細胞名稱、編號和凍存日期。第56頁/共91頁復(fù)蘇復(fù)蘇要做到快融。1、從液氮罐中取出的安瓿要立即放入裝有37℃－40℃溫水的搪瓷杯內(nèi)，并攪動加速融化、2、用乙醇消毒安瓿外表。3、二甲基亞砜對細胞有一定的毒性作用，融化后將細胞立即離心，換新鮮培養(yǎng)液。第57頁/共91頁第六節(jié)動物細胞的培養(yǎng)方法和操作方式一、動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法根據(jù)培養(yǎng)細胞可分為原代細胞培養(yǎng)和傳代細胞培養(yǎng)；根據(jù)培養(yǎng)容器和方式可分為，靜止培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、中空纖維培養(yǎng)、固定床和流化床培養(yǎng)；實際生產(chǎn)可分為懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)和貼壁-懸浮培養(yǎng)。第58頁/共91頁1、懸浮培養(yǎng)優(yōu)點：操作簡單、培養(yǎng)條件均一、傳質(zhì)和傳氧比較好，容易擴大培養(yǎng)規(guī)模，可借鑒細菌發(fā)酵的經(jīng)驗。缺點：體積小，較難采用灌流培養(yǎng)。常用反應(yīng)器為攪拌和氣升式。第59頁/共91頁2、貼壁培養(yǎng)優(yōu)點：適用的細胞種類多，較容易采用灌流培養(yǎng)，達到高密度細胞。缺點：操作比較復(fù)雜，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。第60頁/共91頁3、貼壁-懸浮培養(yǎng)微載體培養(yǎng)。優(yōu)點：可創(chuàng)造相當(dāng)大的貼附面積，載體體積較小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)，發(fā)揮懸浮培養(yǎng)的特長。第61頁/共91頁包埋和微曩培養(yǎng)包埋或包裹在凝膠載體和微曩內(nèi)的細胞可獲得保護，避免了剪切力的損害；可以獲得較高的細胞密度；通過控制微曩膜的孔徑可使產(chǎn)品濃縮在微曩內(nèi)有利于下游處理；可采用多種生物反應(yīng)器進行大規(guī)模培養(yǎng)。第62頁/共91頁多孔載體——由實心微球向開放的內(nèi)部相互連接的多孔微球的轉(zhuǎn)變極大地增加了貼壁面積，其優(yōu)點為：1、提高細胞密度20－50倍；2、同時支持懸浮與貼壁培養(yǎng)；3、很容易達到三維空間的細胞固定；4、到球體內(nèi)的擴散路徑更短；5、適于攪拌、流化床或固定床反應(yīng)器；6、有良好的放大潛力；7、細胞免受剪切力的影響；8、可長期連續(xù)培養(yǎng)。第63頁/共91頁二、動物細胞培養(yǎng)的操作方式分批培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)灌流式培養(yǎng)第64頁/共91頁分批培養(yǎng)將細胞和培養(yǎng)基一次性加入反應(yīng)器內(nèi)，待培養(yǎng)結(jié)束后，放出培養(yǎng)液，進行提取。第65頁/共91頁第66頁/共91頁半連續(xù)培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，每間隔一段時間取出部分培養(yǎng)物，再加入同樣數(shù)量的新鮮培養(yǎng)基。第67頁/共91頁灌流培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)基加入反應(yīng)器后，在產(chǎn)物形成過程中，不斷取出培養(yǎng)基同時不斷補充新鮮培養(yǎng)基。第68頁/共91頁第69頁/共91頁灌流培養(yǎng)的優(yōu)點1、細胞可處于穩(wěn)定良好的環(huán)境中，營養(yǎng)條件好、有害代謝廢物濃度低；2、可極大地提高細胞密度；3、產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間短，可及時分離出產(chǎn)品并在低溫下保存，有利于產(chǎn)品質(zhì)量的提高；4、培養(yǎng)基的比消耗率低，產(chǎn)品質(zhì)量高，成本降低。第70頁/共91頁第七節(jié)動物細胞產(chǎn)品的純化方法和質(zhì)量要求一、動物細胞產(chǎn)品常用的純化方法1、離心純化的早期階段，用以去除細胞、細胞碎片或其他較大的雜質(zhì)。常在低溫下進行。2、離子交換層析根據(jù)各種蛋白質(zhì)所帶的電荷性質(zhì)不同進行分離。第71頁/共91頁3、凝膠過濾根據(jù)各種蛋白質(zhì)分子量大小的差異進行分離。4、親和層析根據(jù)特異性結(jié)合的性質(zhì)，如酶和底物，抗原和抗體。5、鹽析和有機溶劑沉淀6、透析7、高壓液相層析第72頁/共91頁二、動物細胞產(chǎn)品的質(zhì)量要求1、對工程細胞的要求歷史資料：來源、動物年齡和性別、細胞分離的方法和所用的培養(yǎng)基。細胞特性資料：形態(tài)、生長特征、細胞抗原、染色體等。無污染：細菌、真菌、支原體和各種病毒。第73頁/共91頁2、對生產(chǎn)工藝的要求廠房條件符合國家規(guī)定，所用的一切原料、試劑都必須質(zhì)量穩(wěn)定可靠。在細胞培養(yǎng)中盡可能少用或不用小牛血清，必須用時需嚴格挑選，以防病毒和支原體污染。純化過程要低溫進行。純化后的產(chǎn)品需經(jīng)嚴格質(zhì)量檢測，合格后才可分裝。第74頁/共91頁3、對產(chǎn)品的質(zhì)量要求純度生物活性比活性穩(wěn)定性臨床前的安全性和有效性評價臨床試驗的安全性和有效性評價第75頁/共91頁第八節(jié)動物細胞制藥的實例組織纖溶酶原激活劑（tPA）生產(chǎn)工藝：組織纖溶酶原激活劑是一種絲氨酸蛋白酶，它與纖溶酶原親和力低，而與纖維蛋白親和力較大，后兩者結(jié)合后形成的復(fù)合物可提高其與tPA的親和力，使纖溶酶原活化為纖溶酶，后這可水解纖維蛋白，導(dǎo)致血栓溶解，故對血栓性疾病有較好療效。人黑色素瘤細胞株培養(yǎng)后可產(chǎn)生大量的tPA，其培養(yǎng)液中tPA濃度可達到1毫克/升。第76頁/共91頁（1）、工藝流程第77頁/共91頁（2）、工藝過程A、培養(yǎng)基：主要為Eagle培養(yǎng)基，其主要成分（毫克/升）為L-鹽酸精氨酸21，L-胱氨酸12，L-谷氨酰胺292，L-鹽酸組氨酸9.5，L-異亮氨酸26，L-亮氨酸26，L-鹽酸賴氨酸36，L-蛋氨酸7.5，L-苯丙氨酸18，L-蘇氨酸24，L-色氨酸4，L-酪氨酸18，L-纈氨酸24，氯化膽堿1，葉酸1，肌醇2，煙酸1，泛酸鈣1，鹽酸吡哆醛1，核黃素0.1，硫胺素1，生物素1，氯化鈉6800，氯化鉀400，氯化鈣200，七水硫酸鎂200，二水磷酸二氫鈉150，碳酸氫鈉2000，葡萄糖1000。此外尚加入青霉素100單位/毫升，鏈霉素100單位/毫升及10%小牛血清。第78頁/共91頁B、tPA抗體制備：取人tPA或豬心tPA免疫家兔，按每只家兔2000-300微克計，用福式完全佐劑充分乳化注入家兔皮下，每隔兩周再用100微克tPA加強免疫，共加強兩次。然后取家兔血清，用50%硫酸胺鹽析，沉淀于0度對生理鹽水透析及Sephadex75柱層析，得抗tPA的免疫球蛋白G。第79頁/共91頁C、抗tPA親和吸附劑制備：取Sepharose4B用10倍體積蒸餾水分多次漂洗，布式漏斗抽濾，稱取20克濕凝膠于500毫升頸燒瓶中，加蒸餾水30毫升，攪勻后，用2摩爾/升NaOH溶液調(diào)pH11，降溫至18度，在通風(fēng)櫥中另取溴化氰1.5克于乳缽中，用30-40毫升蒸餾水分多次研磨溶解，將溴化氰溶液傾入三頸瓶中，升溫至20-22度，反應(yīng)同時滴加2摩爾/升NaOH溶液維持pH11-12，待反應(yīng)液pH不變時，繼續(xù)反應(yīng)5分，整個操作在15分內(nèi)完成。第80頁/共91頁取出燒瓶，向其中投入小冰塊降溫，永號垂熔漏斗抽濾，然后用300毫升4度的0.1摩爾/升碳酸氫鈉溶液洗滌，再用500毫升，pH10.2，0.025摩爾/升硼酸緩沖液沖洗3-4次，抽濾洗滌，最后轉(zhuǎn)移至250毫升燒杯中，加50-60毫升上述硼酸緩沖液沖洗，即得活化的Sepharose4B備用。第81頁/共91頁另取70-80克上述抗tPA免疫球蛋白G溶于20毫升硼酸緩沖液中，過濾，濾液加至上述活化的Sepharose4B中，10度攪拌反應(yīng)16-18小時，次日裝柱，用10倍柱床體積的pH10.2硼酸緩沖液以5-6毫升/分流速洗滌柱床，收集流出液，并測定A280，然后再依次用5倍柱床體積的pH10.0，0.1摩爾/升乙醇胺溶液及pH8.0，0.1摩爾/升硼酸緩沖液充分洗滌，直至流出液A280＜0.01，所得固定化抗tPA的免疫球蛋白G即為tPA的親和吸附劑，將其轉(zhuǎn)移至含0.01%NaN3pH7.4,0.1摩爾/升磷酸緩沖液中，于4度儲存，備用。第82頁/共91頁D、細胞培養(yǎng)：將人黑色素瘤種質(zhì)細胞按常規(guī)方法消化分散后，洗滌及計數(shù)，稀釋成細胞懸浮液，備用。另取5升玻璃轉(zhuǎn)瓶，按每1平方米表面積2.5升比例加入細胞培養(yǎng)基，然后將上述細胞懸浮液接種至轉(zhuǎn)瓶中，接種濃度為（1-3）×103細胞/毫升，然后置于37度，二氧化碳培養(yǎng)箱中，通入含5%二氧化碳的無菌空氣培養(yǎng)至長成致密單層后，棄去培養(yǎng)液，再用pH7.4，0.1摩爾/升磷酸緩沖液洗滌細胞單層2-3次，再換入無血清Eagle培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。然后每隔3-4天即收獲一次培養(yǎng)液，用于制備tPA，同時向轉(zhuǎn)瓶中加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。如此反復(fù)進行再培養(yǎng)，即可獲得大量t