膠原樣凝集素

膠原樣凝集素

COLLECTIN鄭州大學醫(yī)學院免疫學與微生物學教研室李付廣整理ppt一、凝集素（LECTIN）的分類C-型凝集素:需要Ca2+維持活性的凝集素S-型凝集素:巰基依賴或β-半乳糖結合的凝集素整理ppt二、膠原樣凝集素歷史上的重要發(fā)現1906conglutinin;firstanimallectintobeassociatedwiththeimmunesystem1989-1991mannan-bindinglectin1999collectinliver1(CL-L1)2001collectinplacenta1(CL-P1)2003collectinkidney1(CL-K1)整理ppt三、膠原樣凝集素的一般特性整理ppt四、膠原樣凝集素的結構（一）一級結構特點1.N端富含半胱氨酸區(qū)段：7-28氨基酸，其中1-3半胱氨酸2.膠原樣區(qū)：53-177氨基酸(-Gly-Xaa-Yaa-)n重復序列,Xaa、Yaa多為脯aa或羥脯aa3.頸區(qū)：24-28氨基酸，α-helicecoiled-coils4.糖識別區(qū)（CRDs）：與相應的糖配體結合整理ppt整理ppt(二)三級結構1.同源三聚體的形成(亞單位)相同的三條肽鏈形成類似郁金香花朵2.亞單位進一步聚集成寡聚體單體CL-43,CL-L1四聚體SP-D,Conglutinin,CL-46(十字形結構)六聚體SP-A,MBL(一束郁金香花)整理ppt整理ppt(三)糖結合特異性

膠原樣凝集素的凝集素樣活性存在于CRDs,由三個氨基酸基序決定:1.甘露糖結合基序:Glu-Pro-Asn2.半乳糖結合基序:Gln-Pro-Asp所有膠原凝樣集素(SP-A除外)均具有甘露糖特異基序Glu-Pro-Asn,SP-A第三位的氨基酸由Arg(狗)或Ala替換Asn.整理ppt整理ppt整理ppt系統樹整理ppt(五)結合微生物種類整理ppt五、膠原樣凝集素在宿主防御方面的生物學功能（一）凝集作用通過橋聯，可使病原微生物凝集成大塊，加強呼吸道黏膜纖毛清除作用，阻止病原吸附到細胞表面，抑制其定居和侵入，促進吞噬作用。整理ppt（二）補體激活作用1.MBL產生病原微生物感染早期刺激激活巨噬細胞和中性粒細胞TNF-,IL-1,IL-6急性期反應肝細胞MBL,CRP2.MBL途徑(lectinpathway)MBL與病原微生物表面的mannose,fucose,GlcNAc結合啟動的補體激活級聯反應整理ppt整理ppt整理ppt整理ppt(三)調理作用1.collectin的受體見下表2.collectin直接作為調理素3.激活補體成分C4b,C3b,iC3b4.吞噬作用的激活整理ppt整理ppt整理ppt(四)抑制微生物的生長SP-A,SP-D直接引起微生物細胞壁通透性增強,導致微生物生長抑制或死亡(五)調節(jié)炎癥反應調節(jié)前炎癥因子的合成分泌整理ppt(六)調節(jié)特異性免疫DCs抗原提呈,DCs成熟,T細胞增殖(七)調節(jié)過敏反應SP-A,SP-D抑制IgE與過敏原結合,抑制過敏早期組織胺釋放,抑制晚期支氣管炎癥中淋巴細胞增殖整理ppt(八)對細胞凋亡的影響SP-A抑制Ⅱ型肺泡細胞凋亡,SP-A、SP-D,、MBL刺激凋亡細胞清除整理pptHumanCL-L1的研究1999年Ohtanik.等克隆和鑒定出一個編碼新的膠原凝集素基因，稱肝臟膠原凝集素1（collectinliver1，CL-L1），該基因定位于第八號染色體的長臂上，其基因結構由6個外顯子（EX1～EX6）和5個內含子（IN1～IN5）組成，cDNA含有831bp插入片段，編碼277個氨基酸殘基。推測的氨基酸序列具有典型的膠原凝集素結構：N端富含半胱氨酸區(qū)、膠原樣區(qū)、頸部和糖識別區(qū)。CL-L1與其他膠原凝集素相比，具有獨特之處，MBL、SP-A和SP-D基因定位于第10號染色體，而CL-L1基因定位于第8號染色體，C末端具有4個重復的賴氨酸結構，CRD和頸區(qū)由一個外顯子編碼，膠原樣區(qū)有5個外顯子編碼。膠原凝集素絕大多數為分泌型，存在于體液和分泌液中，只有CL-L1為可溶性胞漿內蛋白，因此推測CL-L1可能具有獨特的功能。整理ppt整理ppt整理ppt整理ppt整理ppt整理ppt整理ppt整理ppt整理ppt整理ppt整理pptComparisonofthreeconstructs

ConstructsMax.O.D.SolubilityIPTGinductionLeakage2GXY+NECK+CRD0.8no(PBS)yesyesNECK+CRD△kkkk1part(TBS),no(PBS)noyes2GXY+NECK+CRD△kkkk1nonoyes整理pptNeck+CRD△kkkk

M123425kDa17kDaMmarker1beforeinductioninduction1hrinduction3hrsinduction5hrs整理pptGrowthofstandardE.coliexpressionculture(200ml)(1)Inoculate20mlofSOB(containingampicillin100g/ml,chloramphenicol35g/ml)in100mlflask.Growtheculturesovernightat37C.(2)Inoculate200mlofprewarmedSOBmediawith10mloftheovernightculturesandgrowat37CwithvigorousshakinguntilanOD600of0.6isreached.(3)Takea1mlsampleimmediatelybeforeinduction.(4)InduceexpressionbyaddingIPTGtoafinalconcentration1mM.(5)Incubatetheculturesfor3hrs.Collectasecond1mlsample.(6)Harvestthecellsbycentrifugationat3500rpmfor25min.(7)Freezethecellsat-70.整理pptPreparationofclearedE.colilysateunderdenaturingconditions

(1)Thawthecellpelletfor15minoniceandresuspendinlysisbufferat5mlpergramwetweight.(2)Stircellsfor15-60minatroomtemperature.(3)Centrifugelysateat10000gfor20-30minatroomtemperaturetopelletthecellulardebris.Savesupernatant,andfilterthesupernatantwith0.45mfilter.(4)Add10l2×SDSsamplebufferto10lsupernatantandstoreat-20CforSDSanalysis.整理pptPurificationofNeck+CRD△KKKKofhCL-L1withNi-NTAcolumn

(1)Equilibratecolumnwith5columnvolumesoflysisbuffer.(2)Applylysatetocolumn.Collectthepass-throughforSDSanalysis(recycleonce).(3)Washwith10columnvolumesofwashbufferuntilA280isbelow0.01.(4)Eluteproteinwithelutionbuffer.Collectthesingleproteinpeakcompletely.整理pptDialysisofrecombinantproteinbuffer18Murea

TBS(pH7.6)/300ml;buffer2TBS(pH7.6)/3000ml(1)Addelutionintomembranetube(MWCO15000),putthemembranein300mlbuffer1,stirringslowly.(2)Add100mlbuffer2at6hourintervals,total8times.(3)Atlastputmembranein2000mlbuffer2fordialysisovernight.整理ppt1234M25kDa16.5kDaMmarker1,3beforei