基因重組與基因工程geneticrecombinationand課件

第十七章基因重組與基因工程

(geneticrecombination

andgeneticengineering)1基因重組

是指在體外用酶學(xué)方法將不同來源的DNA進行切割、連接，組成一個新的DNA分子的過程，又稱DNA重組?；蚩寺?/p>

將重組DNA分子導(dǎo)入到合適的受體細胞中，使其擴增和繁殖，以獲得大量的同一DNA分子，稱此為基因克隆、DNA克隆或分子克隆?；蚬こ?/p>

實現(xiàn)基因克隆所采用的方法和相關(guān)工作，統(tǒng)稱為重組DNA技術(shù)或基因工程。2

本章主要內(nèi)容重要的工具酶基因克隆常用的載體重組DNA基本原理重組技術(shù)在醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)中的應(yīng)用3一、限制性核酸內(nèi)切酶(RE)是一類由細菌產(chǎn)生的能專一識別雙鏈DNA中的特定堿基序列、并水解該點磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶，簡稱限制酶或切割酶。

根據(jù)限制酶的作用特性，一般分為三類：——Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制酶。

5

限制酶（Ⅱ型）識別及切割位點特異識別及切割48個bp長度且具有回文序列的DNA片斷，主要產(chǎn)生3種缺口：5ˊ－粘性末端

3ˊ－粘性末端平端或鈍端

回文序列是指該部位的核苷酸序列呈180O旋轉(zhuǎn)對稱;

粘性末端是指經(jīng)內(nèi)切酶特異切割后產(chǎn)生的5ˊ－末端突出或3ˊ－末端突出的堿基序列相互具有互補性。6⑴產(chǎn)生5'-粘性末端

⑵產(chǎn)生3'-粘性末端7⑶產(chǎn)生平(頭末)端/鈍端其它特殊性質(zhì)的Ⅱ型限制酶同裂酶（異源同工酶）同尾酶可變酶8同裂酶——同識同切10同裂酶——同識異切11可變酶可變酶

識別順序中的一個或幾個堿基是可變的，并且識別順序往往超過6個堿基對。如，BstpⅠ，其識別順序為GGTNACC。13

常用限制性核酸內(nèi)切酶的特性微生物名稱酶名稱識別順序同裂酶同尾酶BacillusamyloliquefaciensH解淀粉芽孢桿菌BamHⅠGGATCCBstⅠBglⅡMboⅠBacilliusglobigil球芽孢桿菌BglⅡACATCTEscherichiacoliRY13大腸桿菌EcoRⅠGAATTCHaemophilusinfluenzae流感嗜血菌HindⅢAAGCTTHsuⅠProvidenciastuartii164普羅威登細菌PstⅠCTGCAGSalpⅠStreptomycesalbusSubspeciespathocidicus白色鏈球菌SalⅠGTCGACAvaⅠXhoⅠ14二、DNA聚合酶

（最常用的DNA聚合酶有以下4種）DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段TaqDNA聚合酶T4噬菌體DNA聚合酶15DNApolⅠ應(yīng)用⑴催化DNA缺口平移反應(yīng)，制備高比活性DNA探針；⑵第二條cDNA鏈的合成；⑶對DNA3’突出末端進行標記；⑷DNA序列分析。17E.coliDNApol.Ⅰ催化切口平移18㈡Klenow片段（DNApol.大片斷）19

㈢TaqDNApol（耐熱DNA聚合酶）

作用特點1）TaqDNApol催化DNA合成的最適溫度范圍7075℃，2）95℃以上高溫，半小時不失活，3）最適合用于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。21三、逆轉(zhuǎn)錄酶

特點

逆轉(zhuǎn)錄酶是一個多功能性酶，至少具有以下3種酶活性：⑴以單鏈RNA為模板，催化合成cDNA單鏈⑵具有RNaseH活性，能水解RNA:DNA雜交鏈中的RNA⑶以DNA為模板，催化合成cDNA雙鏈。22

逆轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用：⑴將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，構(gòu)建cDNA文庫；⑵補平和標記5ˊ-末端突出的DNA片段；⑶代替Klenow酶用于DNA序列分析；⑷制備雜交探針等。23五、堿性磷酸酶

堿性磷酸酶(BAP)能夠催化水解去除DNA或RNA5ˊ-端的磷酸基團。用途⒈制備載體時，用堿性磷酸酶處理去除載體分子5ˊ－端磷酸基后，可防止載體自身環(huán)化連接，提高重組效率。⒉用32P標記5'-端前，去除5'-P，再通過激酶作用把放射性核苷酸加到5'-端進行標記。25六、末端（脫氧核苷酸）轉(zhuǎn)移酶(TdT)

作用

將標記或未標記的dNTP加到DNA的3ˊ—OH末端；也可催化載體分子或待克隆的DNA片斷上加上互補的同聚尾，便于進一步連接。應(yīng)用①探針標記

P32-α.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32

②在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于進行連接26一、載體必須具備的基本條件⒈有自身的復(fù)制子，能獨立復(fù)制⒉具備多個限制酶的識別位點(多克隆位點)⒊具有遺傳表型或篩選標記⒋有足夠的容量以容納外源DNA片段。⒌表達型載體還應(yīng)具備與宿主細胞相適應(yīng)的啟動子、前導(dǎo)序列、增強子等調(diào)控元件。⒍載體DNA中均有一段非必需區(qū)，將外源基因插入該非必需區(qū)，而載體本身不受影響。29二、載體的種類*（一）克隆載體

用來克隆和擴增DNA片段的載體，具有3點共性：⑴能夠在受體細胞復(fù)制；⑵帶有藥物抗性基因，便于篩選；⑶可導(dǎo)入受體細胞。（二）表達載體除具有克隆載體所具有的性質(zhì)外，還帶有表達構(gòu)件——轉(zhuǎn)錄和翻譯所必須的DNA順序。30三、常用的載體

（一）質(zhì)粒(plasmid)：

是存在于細菌染色體外的、能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子。

作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備以下特點：1.分子量相對較小，能穩(wěn)定存在于細菌體內(nèi)，有較高的拷貝數(shù)2.具有1個以上的遺傳標志，便于篩選3.具有多克隆位點

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總而言之，質(zhì)粒載體應(yīng)該是一種分子量較小、高拷貝的“松弛型”質(zhì)粒，且具有一個以上遺傳標志和多克隆位點的質(zhì)粒。廣泛應(yīng)用的質(zhì)粒：

pBR32質(zhì)粒、pUC系列等32

pBR322質(zhì)粒①4363bp②含一個復(fù)制點含一個抗氨卞青霉素標記(ampR)④一個抗四環(huán)素標記(tetR)⑤ampR和tetR基因內(nèi)各有一些限制酶的酶切位點，供外源基因插入當外原基因插入抗藥基因位點時，AmpR→Amp敏感(AmpS)、TetR→Tet敏感(TetS).33pUC系列質(zhì)粒

由pBR322和M13噬菌體構(gòu)建而成的雙鏈質(zhì)粒載體；（1）2674bp；（2）有ampr和與M13噬菌體相同的多克隆位點（MCS）（3）有一個來自大腸桿菌的LacZ操縱子的DNA片斷,編碼半乳糖苷酶34(二)λ噬菌體組成特點：雙鏈線狀DNA分子，全長50kb，含65個基因，在其分子兩端各含有12個堿基的互補單鏈，是天然的粘性末端，被稱為COS位點。35

λ噬菌體感染細菌后的溶菌性生長和溶源性生長

溶菌性生長（lyticpathway）噬菌體感染細菌后，借助其2個COS位點互補成環(huán)，在宿主菌體內(nèi)連續(xù)復(fù)制，合成大量基因產(chǎn)物，進而裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌，釋放出來的噬菌體又可感染其他細菌。

溶源性生長(lysogenicpathway)噬菌體感染細菌后，可將自身DNA整合到細菌的染色體中去，與之一起復(fù)制，并遺傳給子代細胞，宿主細胞不被裂解。36

λ噬菌體兩種生長途徑（示意圖）37

第三節(jié)重組DNA基本原理（DNA重組基本程序包括下列過程）

分—獲取目的基因和載體接—目的基因與載體的連接轉(zhuǎn)—重組DNA導(dǎo)入宿主細胞篩—重組DNA的篩選與鑒定381、獲取

DNA重組基本過程392、重組403、轉(zhuǎn)化414、篩選425、克隆436、表達表達產(chǎn)物分離純化44一、目的基因的獲?。ǚ郑┠康幕蚴侵杆芯炕驊?yīng)用的基因，也是需要克隆或表達的基因。

目的基因來源

1）制備基因組DNA2）制備cDNA3）聚合酶鏈反應(yīng)4）人工合成基因45（一）制備基因組DNA（基因文庫）分離、純化基因組DNA

條件：溫和，在EDTA或SDS等存在下

↓RE用蛋白酶K消化細胞、酚抽提大小不同酶切片段

片段分離：常用蔗糖梯度或電泳分離

↓分別與同樣RE消化的載體連接常用噬菌體載體或質(zhì)粒載體

↓DNA連接酶連接。

導(dǎo)入細胞進入宿主細胞內(nèi)培養(yǎng)擴增。

↓

篩選鑒定用分子雜交、凝膠電泳等方法鑒定。46（二）制備cDNA（cDNA文庫）（1）合成cDNA第一條鏈反應(yīng)體系只有mRNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、4種dNTP、引物。引物是與mRNA3ˊ端polyA互補的寡聚dT（12～18dT片段）（2）合成cDNA第二條鏈RNase去掉模板mRNA（3）構(gòu)建cDNA文庫①cDNA兩端加接頭或銜接頭接頭是人工合成的雙鏈寡核苷酸兩端平頭，含有限制酶切位點。銜接頭是另一種人工合成的雙鏈寡核苷酸一端平頭，另一端為粘性末端。②cDNA與載體相連。③導(dǎo)入宿主細胞進行克隆，這些菌體內(nèi)保存cDNA集合體便是cDNA文庫。47（二）制備cDNA（cDNA文庫）

分離目的基因的mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA單鏈水解去除mRNA，合成cDNA雙鏈水解回折處單鏈得到平端雙鏈cDNA導(dǎo)入宿主細胞克隆,構(gòu)建cDNA文庫48（三）聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

在模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等條件下，體外經(jīng)94℃變性、54℃退火及72℃延伸3個步驟的反復(fù)多次循環(huán)（2530次），擴增目的基因（見18章）。

（四）人工合成基因

引用DNA測序儀測出某一基因的堿基序列，或根據(jù)某一蛋白質(zhì)的氨基酸組成反推核苷酸序列，再用DNA合成儀通過化學(xué)合成原理合成目的基因。

一般先合成短片斷DNA，然后再拼接成長片段。49二、目的基因與載體的連接（接）

（主要有以下4種連接方式）1)粘性末端連接2）平頭末端連接3）人工接頭法4）同源多聚尾連接法50

（一）粘性末端連接

將目的基因和載體用同一種限制酶酶切，產(chǎn)生相同粘性末端，再通過DNA連接酶作用將兩者連接起來，構(gòu)成重組DNA分子。

（二）平頭末端連接

某些限制酶只能將目的基因和載體DNA切割成平端，此時在T4DNA連接酶的作用下同樣能連接起來。51（三）人工接頭法合成連接子→與DNA平頭末端連接→限制酶切割,產(chǎn)生粘性末端→連接，構(gòu)建重組DNA。52（四）同源多聚尾連接法53三、重組DNA導(dǎo)入宿主細胞（轉(zhuǎn)）

無性繁殖

體外重組后的DNA導(dǎo)入受體細胞，形成轉(zhuǎn)化子。然后隨受體細胞生長、增殖，使重組DNA發(fā)生復(fù)制、擴增，這一過程稱為無性繁殖?？寺?/p>

從上述無性繁殖細胞中進一步篩選出含目的DNA的重組體分子即為無性繁殖系或克隆。宿主細胞

進行無性繁殖時所采用的受體細胞.54

重組DNA導(dǎo)入宿主細胞的類型轉(zhuǎn)化以質(zhì)粒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細胞的過程；轉(zhuǎn)染以病毒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細胞的過程；轉(zhuǎn)導(dǎo)以噬菌體作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細胞的過程。

感受態(tài)細胞

用特殊方法處理后，受體細胞才具備接受外源DNA的能力，這種細胞稱感受態(tài)細胞。感受態(tài)細胞有原核細胞和真核細胞兩大類。55四、重組DNA的篩選與鑒定（篩）（篩選含重組體的陽性菌落，一般有下列幾種方法）

1）平板篩選2）限制酶切圖譜篩選3）PCR篩選重組體4）原位雜交技術(shù)插入失活藍－白篩選56（一）平板篩選

是指利用載體的遺傳性標記直接篩選的方法。如，具有抗藥性標記的載體，轉(zhuǎn)化宿主細胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培養(yǎng)平板上生長；未轉(zhuǎn)化的則不能生長。插入失活

當外源DNA序列插入質(zhì)粒中某一抗藥基因內(nèi)，使該基因失活，轉(zhuǎn)化細胞就不能生長在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平板上。57

抗生素平板篩選（插入失活）58（2）藍-白篩選

它是一種利用藍色化合物的形成作為指示劑的篩選方法，篩選含有編碼β-半乳糖苷酶的基因。

載體：編碼β-半乳糖宿主：編碼β-半乳糖苷酶N端序列苷酶C端序列α-互補細菌表達：β-半乳糖苷酶活性蛋白↑5-溴-4-氯-3-吲哚（

X-gal）→

形成藍色菌落

當在質(zhì)粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→不能與宿主β-半乳糖苷酶的C端進行α-互補→產(chǎn)生白色菌落。

（IPTG存在下）

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藍－白篩選示意圖602.限制性內(nèi)切酶圖譜鑒613.PCR篩選重組體

抽提少量重組DNA→PCR擴增→電泳鑒定→序列分析。4.原位雜交技術(shù)62五、重組體在宿主細胞中的表達和調(diào)控

基因工程的最終目的是通過載體將外源基因?qū)牒线m的宿主細胞中高效表達，產(chǎn)生有重要價值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。

克隆基因表達有三個條件

⑴基因的編碼區(qū)不能被插入序列所中斷;

⑵基因轉(zhuǎn)錄要有啟動子，而啟動子必須能被宿主

細胞的RNA聚合酶有效地識別;

⑶mRNA必須相當穩(wěn)定，并有效地被翻譯，產(chǎn)生的外

源蛋白質(zhì)必須不為宿主細胞的蛋白酶所降解。63第四節(jié)重組技術(shù)在醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)中的應(yīng)用

一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)

1990年美國科學(xué)家首先啟動人類基因組計劃（HGP），計劃歷時15年，至2005年完成；

2001年2月12日由Since和Nature雜志同時向世界宣布，人類基因組3X109bp的最新圖譜，約含34萬個基因；整個人類基因組的全部核苷酸序列不久即將完成。但要揭示人類4萬個基因功能的任務(wù)將更為艱巨。64

人類基因組圖譜的初步完成，不僅為全部基因的定位建立了一個開放框架，而且為分離、鑒定人類疾病相關(guān)基因提供了參照模板。如，已知人類遺傳性疾病約有3000種，推測可能是由于某些基因結(jié)構(gòu)異?；蚧蛭灰频韧蛔兯?。如果利用分子生物學(xué)技術(shù)，將患者疾病基因與正常基因圖譜作對照分析，必將有助于闡明遺傳病的分子機制，這對遺傳病的基因治療將起到不可估量的推動作用。65

產(chǎn)品名稱治療功能與醫(yī)藥范圍1.人胰島素治療糖尿病2.人生長激素治療侏儒癥，加速創(chuàng)口愈合

3.α干擾素治療癌癥、病毒感染4.β干擾素治療帶狀皰疹，眼結(jié)、角膜炎5.γ干擾素治療癌癥、病毒感染6.人