實(shí)驗(yàn)八聚炳烯凝膠電泳課件

血清蛋白的分離

聚丙烯酰胺凝膠電泳法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理2)掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳的操作技術(shù)二.基本原理(一)電泳電泳:帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下,向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象.(二)聚丙烯酰胺凝膠電泳用丙烯酰胺(Acr)單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑作用下聚合成的多孔介質(zhì).以此凝膠為支持物的電泳稱(chēng)為聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡(jiǎn)稱(chēng)PAGE)。分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%)

104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10

5×105 2-5 蛋白分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系2.凝膠濃度的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)

3凝膠聚合催化體系（1）光催化：核黃素

（2）化學(xué)催化：AP-TEMED催化體系Bis將單體長(zhǎng)鏈間連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)4.聚丙烯酰胺凝膠種類(lèi)(1)連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類(lèi)

不連續(xù)系統(tǒng):是指使用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系的電泳方式，在電泳分離過(guò)程中，由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，對(duì)樣品進(jìn)行濃縮，然后在一定濃度或濃度梯度的凝膠上進(jìn)行分離，既存在電荷效應(yīng)，也有分子篩效應(yīng)。雖然制膠操作難度較大，但是它具有連續(xù)系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)越性，分辨率高。

(2)不連續(xù)體系:電極緩沖液、濃縮膠及分離膠濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。

1)樣品濃縮效應(yīng)A.凝膠孔徑不連續(xù)性B.緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性C.電位梯度的不連續(xù)性2)分子篩效應(yīng)3)電荷效應(yīng)(3)不連續(xù)體系凝膠對(duì)蛋白的分離作用電泳裝置電泳儀：提供直流電在電泳槽中產(chǎn)生電場(chǎng)，驅(qū)動(dòng)帶電分子的遷移垂直平板電泳槽每組（3人）做一板膠，前后可安置兩副板，兩組共用一套電泳裝置。四.實(shí)驗(yàn)試劑人血清；分離膠緩沖液：Tris-HCl緩沖液PH8.9；濃縮膠緩沖液:Tris-HCl緩沖液PH6.7；分離膠貯液:Acr28.0g,Bis0.735g,無(wú)離子水溶解定容至100ml；濃縮膠貯液:Acr10.0g,Bis2.5g,無(wú)離子水溶解定容至100ml；過(guò)硫酸銨溶液（AP）電泳緩沖液:Tris-甘氨酸緩沖液PH8.3；固定染色液脫色液五.操作步驟(一).垂直平板電泳槽的安裝注意短玻璃板是向內(nèi)側(cè)的。要將玻板底邊平齊地壓緊在紅色橡膠條上，否則容易漏膠。(二).凝膠的制備1分離膠的制備(7%)配8mL(按如下順序加入）分離膠緩沖液1mL分離膠貯液2mL去離子水4mLTEMED2uL過(guò)硫酸胺（AP)1mL將上述試劑迅速混勻后，用滴管沿壁迅速加樣至2/3處，再取大約3mL的水加在上面直至凝膠凝固為止。加入此物后請(qǐng)迅速混勻加樣，否則易凝固無(wú)法加樣凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面.

水封的目的是為了使分離膠上緣平直，并排除氣泡凝膠凝聚后，垂直小心拔出加樣梳，用窄條濾紙吸在玻板邊緣吸去多余的液體。(三).進(jìn)樣除去底板，將制膠裝置放在電泳槽內(nèi)，加入稀釋10倍的Tris－甘氨酸電極緩沖液（注意：加緩沖液先從內(nèi)槽加入，上面沒(méi)過(guò)短玻璃板，外槽液面沒(méi)過(guò)最下一個(gè)螺絲處,加樣前要使凝膠凹形樣品槽內(nèi)的氣泡全部排出,否則會(huì)影響加樣效果.（用針筒將凹洞中的氣泡抽出）(四).電泳將電泳儀的正極負(fù)極與電泳槽連接（方向切勿接錯(cuò)），打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)，開(kāi)始時(shí)將電壓調(diào)至150V，待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，將電壓調(diào)至250V。當(dāng)藍(lán)色染料遷移至距離凝膠下端2cm時(shí)，將電流調(diào)回到零，關(guān)閉電源。電泳結(jié)束后，卸下膠框，用凝膠鏟小心撬開(kāi)短玻璃板，（不要撬兩邊耳朵處，易斷裂）在膠板一端切除一角作為標(biāo)記，用緩沖液沖洗膠板，將其移至大培養(yǎng)皿中染色?！鶆兡z時(shí)要小心,保持膠完好無(wú)損,染色要充分.1、Acr和Bis為神經(jīng)毒劑，對(duì)皮膚有刺激作用，操作應(yīng)戴手套。2、玻璃板表面應(yīng)光滑潔凈，否則在電泳時(shí)會(huì)造成凝膠板與玻璃板或硅橡膠條剝離，產(chǎn)生氣泡或滑膠；撥膠時(shí)凝膠板易斷裂，為防止此現(xiàn)象，所用器材均應(yīng)嚴(yán)格的清洗。

3、安裝電泳槽和鑲有長(zhǎng)、短玻璃板的硅橡膠框時(shí)，位置要端正，均勻用力旋緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏，但亦不可太用力旋，易將玻板邊緣壓破。

4、制備濃縮