發(fā)酵工業(yè)制藥part3課件

六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用主要應(yīng)用：

1.提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量

2.改進(jìn)代謝產(chǎn)物的組分

3.改進(jìn)菌種的生理性能

4.產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物㈠提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量基因工程技術(shù)提高抗生素產(chǎn)量的主要手段增加限速酶的基因拷貝數(shù)增加正調(diào)節(jié)基因，去除負(fù)調(diào)節(jié)基因增加抗性基因的拷貝數(shù)六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用1.增加限速酶的基因拷貝數(shù)原理：ABCDE（代謝產(chǎn)物）

EaEbEcEd限速酶Rate-limitingBottleneck例1：起始原料ACV三肽異青霉素N青霉素EaEbEcα-aminoadipicacidL-cvstcincEa：ACV合成酶Ec：異青霉素N?；饷窵-valincEb：異青霉素N合成酶青霉素?；D(zhuǎn)移酶六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用增加IPNS基因提高青霉素產(chǎn)量六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用例2.頭孢菌素C的生物合成的限速酶在頭孢菌素C的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，人們發(fā)現(xiàn)發(fā)酵結(jié)束后在得到的發(fā)酵液中，除了主要產(chǎn)物是頭孢菌素C外，在發(fā)酵液中還積累另一種產(chǎn)物-青霉素N。問題：積累中間產(chǎn)物-青霉素N原因：下一步反應(yīng)為限速酶反應(yīng)解決：導(dǎo)入額外的擴(kuò)環(huán)酶/羥化酶基因結(jié)束：使頭孢菌素C的產(chǎn)量提高25-50%，積累的青霉素N消失。六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用增加限速酶基因提高頭孢菌素C的產(chǎn)量六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用增加限速酶的其它例子-4：例4.泰洛星（Tylosin）產(chǎn)生菌：氟式鏈霉菌（S.fradiae）acetylCoA+malonyCoAPolyketidepathway構(gòu)建重組質(zhì)粒（帶甲氧基轉(zhuǎn)移酶）轉(zhuǎn)化到氟式鏈霉素（

S.fradiae

）泰洛星（Tylosin）產(chǎn)量顯著提高甲氧基轉(zhuǎn)移酶大菌素（macrocin）Tylosin轉(zhuǎn)化菌株六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用2.增加正調(diào)節(jié)基因，去除負(fù)調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因根據(jù)其作用的不同分為正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)。正調(diào)節(jié)促進(jìn)生物合成結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，負(fù)調(diào)節(jié)阻扼結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。將帶有正調(diào)節(jié)基因片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到生產(chǎn)菌株中，由于轉(zhuǎn)錄功能的增強(qiáng)，使生物合成結(jié)構(gòu)基因得以高水平的表達(dá)，提高了代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。反之，對(duì)于負(fù)調(diào)節(jié)基因，通過基因工程的手段，將其祛除或失活，就能解除阻扼作用，同樣導(dǎo)致使生物合成結(jié)構(gòu)基因高水平的表達(dá)，提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇內(nèi)的正負(fù)調(diào)節(jié)基因基因效應(yīng)菌株次級(jí)代謝物功能brpA正吸水鏈霉素Bioalaphos激活bar（Bialaphos抗性基因和6個(gè)bap（生物合成）基因的轉(zhuǎn)錄ty1G正弗式鏈霉菌泰洛星激活tylF（編碼MOMT）和其它tyl生物合成基因的表達(dá)actII正天藍(lán)色鏈霉菌放線紫紅素能使act菌株放線紫紅素的產(chǎn)量增加30~40倍mmy負(fù)天藍(lán)色鏈霉菌次甲霉素該基因的插入失活導(dǎo)致次甲霉素過量生產(chǎn)strR正灰色鏈霉菌鏈霉素調(diào)節(jié)鏈霉素的生物合成調(diào)節(jié)基因在次級(jí)代謝產(chǎn)物合成中的作用六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用2.增加抗性基因的拷貝數(shù)抗性基因的作用是避免抗生素產(chǎn)生菌被自身的代謝產(chǎn)物所殺滅。其作用可通過三條途徑實(shí)現(xiàn)：1.抗性基因產(chǎn)物（酶）將抗生素作用的底物加以修飾；2將抗生素的分子結(jié)構(gòu)加以修飾，使其失活；3將抗生素分子排出細(xì)胞外。提高菌種耐受自身產(chǎn)生抗生素的能力是取得高產(chǎn)的前提，此外，將胞內(nèi)的抗生素排出胞外，還可以解除高濃度代謝產(chǎn)物對(duì)其生物合成的反饋調(diào)節(jié)，使產(chǎn)物大量合成。將抗生素抗性基因片段連接到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒上，用得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化抗生素生產(chǎn)菌株，就可能使抗生素的產(chǎn)量得以提高。六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用增加抗性基因拷貝提高抗生素的產(chǎn)量例1.DaviesJ.利用鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702從卡拉霉素產(chǎn)生菌克隆了6‘-N-氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC6’的基因（aacA），該基因產(chǎn)物在乙酰輔酶A的存在下，可將氨基糖苷類抗生素的氨基糖6‘乙?；acA基因轉(zhuǎn)入新霉素和卡那霉素的產(chǎn)生菌中，結(jié)果顯著提高了抗生素的產(chǎn)量。六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用卡拉霉素6’-乙酰轉(zhuǎn)移酶[AAC(6’)]的作用六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用㈡改進(jìn)代謝產(chǎn)物的組分鏈霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物常常是一組結(jié)構(gòu)相似的混合物。每個(gè)化合物稱它為它的一個(gè)組分。多組分產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)是因?yàn)榇渭?jí)代謝產(chǎn)物的合成酶對(duì)底物的選擇性不強(qiáng)以及合成途徑中分支途徑的存在。通過基因工程手段，滅活某分支途徑的酶，就可以去除該分支途徑的產(chǎn)物。此策略常用來去除發(fā)酵產(chǎn)物中的無用組分，提高有用組分的含量。六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用例一：阿維菌素產(chǎn)生菌的基因改造六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用阿維菌素“B”組分轉(zhuǎn)化成“A”組分的分子基礎(chǔ)六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用阿維菌素生物合成基因簇六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用1.用基因工程手段滅活C5-氧甲基轉(zhuǎn)移酶基因主要過程：克隆阿維菌素生物合成的aveD基因構(gòu)建genedisruption質(zhì)粒轉(zhuǎn)化阿維菌素產(chǎn)生菌（S.avermitilis）挑選雙交換菌株陽性菌株的發(fā)酵發(fā)酵產(chǎn)物的組分分子（HPLC，質(zhì)譜）六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用DisruptionplasmidofaveDgene六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用D24-1組分的質(zhì)譜分析六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用重組質(zhì)粒的構(gòu)建圖質(zhì)粒pC05的構(gòu)建過程六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用Genereplacement（基因置換）六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用遺傳型的改變六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用基因工程菌AveC-9發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析Control基因工程菌AveC9阿維鏈霉菌aveC基因阻斷變株產(chǎn)物的HPLC分析六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用例一：黑暗鏈霉菌的基因改造黑暗鏈霉菌首先是從墨西哥土壤中分離得到的，1967由美國(guó)禮萊公司（EliLilyCo.）最初報(bào)道了黑暗鏈霉菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物-尼拉霉素復(fù)合物，它包括1、1‘、2、4、5、5’、6、7等15個(gè)組分。其中組分2、4、5‘為尼拉霉素的主組分，其他組分為小組分。組分2為安普霉素（Apramycin），組分4為6“-O-氨甲?？敲顾谺（6”-O-CarbamoylkanamycinB,CKB），組分5’為6“-O-氨甲酰托普霉素（6”-O-Carbamoyltobramycin，CTB）

七八十年代，我國(guó)中科院微生物所與四川抗生素工業(yè)研究所先后分離到黑暗鏈霉菌的新菌株：黑暗鏈霉菌410與黑暗鏈霉菌83-1050B，它們的組分中含有尼拉霉素組分2、4、5‘。經(jīng)過“七五”攻關(guān)中篩選到了只產(chǎn)組分2（Apramycin）、5’（6“-O-Carbamoltobramycin，CTB）的菌株U-135。六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用黑暗鏈霉菌（S.tenebrarius）菌株U-135產(chǎn)生的兩種主要抗生素六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用妥布霉素（Tobramycin）妥布霉素是氨基糖苷類抗生素，它是黑暗鏈霉菌（S.tenebrarius）產(chǎn)生的尼拉霉素復(fù)合物的組分5‘。它對(duì)革蘭氏陰性菌有很高的抗菌活性。特別是對(duì)綠膿桿菌有獨(dú)特的抗菌作用，因此常用來治療燒傷后的綠膿桿菌感染。臨床上使用的妥布霉素是由黑暗鏈霉菌經(jīng)過發(fā)酵后，經(jīng)過樹脂吸附，層析后得到中間產(chǎn)物6”-O-氨甲酰托普霉素，然后再將6“-甲?；獾簦玫酵撞济顾?。六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用安普霉素（Apramycin）Abriefintroductiontoapramycin安普霉素是氨基糖苷類抗生素，它是黑暗鏈霉菌（S.tenebrarius）產(chǎn)生的尼拉霉素復(fù)合物的組分2.它對(duì)革蘭氏陰性菌和葡萄糖球菌有很高的抗菌活性。由于分子中具有獨(dú)特的辛二糖結(jié)構(gòu)，對(duì)多種氨基糖苷類抗生素的耐藥菌仍有抑制和殺滅作用，與常用的氨基糖苷類抗生素不易產(chǎn)生交叉耐藥性。80年代在美國(guó)和歐洲安普霉素作為獸用抗生素和飼料添加劑投入市場(chǎng)。六、基因工程技術(shù)在改進(jìn)微生物菌種方面的應(yīng)用安普霉素/妥布霉素生物合成基因簇的位置通過鳥槍克隆法從黑暗鏈霉菌H-6中克隆到了安普霉素抗性基因aprR在抗基因上游片段找到一個(gè)完整的ORF，定名為aprA。將抗性基因上游片段和報(bào)告基因crmE，xyIE插入到帶有aprA片段的質(zhì)粒。pHZ132中，得到重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化黑暗鏈霉菌得到雙交換的菌株42