重組子篩選課件

重組子的篩選重組子的篩選并非所有的受體細胞都能導入重組子DNA分子,導入外源DNA分子的受體細胞不一定能良好增殖。為了從眾多的受體細胞中篩選出含有外源重組DNA的克隆子，必需利用載體、宿主細胞的特性對受體細胞進行篩選或選擇。重組子的篩選導入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細胞稱為轉(zhuǎn)化子。含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子稱為重組子。如果重組子中含有目的基因，稱為陽性克隆子，或期望重組子。重組子的篩選將轉(zhuǎn)化處理后的受體細胞接種在選擇培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一定時間，根據(jù)菌落生長情況挑選轉(zhuǎn)化子。在普通培養(yǎng)基中加入適量的某種選擇物，即為選擇培養(yǎng)基。選擇物由載體DNA分子上攜帶的選擇標記基因所決定，如：抗生素、顯色劑。重組子的篩選篩選方法主要包括：1.抗藥性篩選2.顯色篩選3.依據(jù)重組子結(jié)構(gòu)特征篩選抗藥性篩選利用載體上的抗藥性選擇標記進行篩選。氨芐青霉素（Ap或Amp），bla基因可以編碼β丙酰胺酶，可降解Ap氯霉素（Cm或Cmp），cat基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)酰基酶，使Cm乙?；Э敲顾兀↘m或Kan），Km抗性基因可以轉(zhuǎn)譯一種能修飾Km的酶，阻斷Km對核糖體的干擾?？顾幮院Y選四環(huán)素(Tc或Tet)，Tc抗性基因轉(zhuǎn)譯一種能改變細菌膜的蛋白，防止Tc進入細胞后干擾細菌蛋白質(zhì)的合成。鏈霉素(Sm或Str)，Sm抗性基因轉(zhuǎn)譯一種能修飾Sm的酶，抑制Sm與核糖體結(jié)合?？顾幮院Y選插入失活外源目的基因插入載體后，抑制篩選標記基因的表達。插入表達外源目的基因插入載體后，激活篩選標記基因的表達。在篩選標記基因前連上一段負調(diào)控序列。顯色篩選原理：如果在載體DNA上組入LacZ’，則重組DNA分子會在含有X-gal和IPTG的培養(yǎng)基中得到藍色的轉(zhuǎn)化子菌落。由于被轉(zhuǎn)化的基因產(chǎn)物作用于X-gal需要較長的時間，因此觀察和確定轉(zhuǎn)化子菌落的培養(yǎng)時間可適當延長。依據(jù)重組子結(jié)構(gòu)特征進行篩選凝膠電泳分析：在轉(zhuǎn)化子篩選的基礎(chǔ)上，依據(jù)有外源DNA片段的重組質(zhì)粒與載體DNA之間的大小差別來區(qū)分重組子和非重組子。1.在平板上挑選菌落2.將菌落放入細菌裂解液，懸浮－離心－取上清3.電泳優(yōu)點：直觀、快捷、尤其適用于插入片段較大的重組子的篩選。缺點：載體可能會與一個以上的外源DNA片段連接依據(jù)重組子結(jié)構(gòu)特征進行篩選限制性核酸內(nèi)切酶酶切分析：從轉(zhuǎn)化菌落中挑選菌落，提取質(zhì)粒，用限制性核酸內(nèi)切酶進行酶切，然后通過凝膠電泳分析。優(yōu)點：可以判斷DNA分子插入的方向及分子量的大小。利用PCR方法篩選重組子外源DNA兩側(cè)序列多數(shù)是已知的通過兩側(cè)序列設(shè)計引物，擴增電泳篩選植物轉(zhuǎn)化細胞在植物轉(zhuǎn)基因研究中，載體攜帶的選擇標記基因經(jīng)常稱為“報告基因”，在有選擇壓力的情況下，可利用報告基因在受體細胞內(nèi)的表達篩選轉(zhuǎn)化細胞。篩選植物轉(zhuǎn)化細胞熒光素酶基因（LUC）:LUC是一種源于螢火蟲的動物蛋白基因產(chǎn)物，能夠催化生物發(fā)光反應(yīng)。熒光素酶可以在植物細胞內(nèi)正常表達優(yōu)點：檢測迅速、靈敏度高、無污染，是一種理想的報告基因。篩選植物轉(zhuǎn)化細胞抗除草劑基因(bar)：bar基因編碼的酶能夠解除非選擇性除草劑的毒性除草劑是一種谷氨酸類似物，強烈抑制谷胺酰胺合成酶，從而導致植物體內(nèi)氨的積累，并使植物死亡bar基因可以將除草劑乙?；?，從而使植物具有除草劑的抗性。篩選植物轉(zhuǎn)化細胞氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT），可以催化氯霉素失活，因此，與外源DNA共轉(zhuǎn)化的Cat基因能使轉(zhuǎn)基因植物具有抗氯霉素的活性。哺乳動物轉(zhuǎn)基因細胞的篩選胸苷激酶