ES細(xì)胞的誘導(dǎo)與應(yīng)用課件

ES細(xì)胞的誘導(dǎo)與應(yīng)用

本次課的主要內(nèi)容ES細(xì)胞的定義，及其研究發(fā)展史。ES細(xì)胞的分離培養(yǎng)和生理特性。ES細(xì)胞的自我更新，誘導(dǎo)分化。ES細(xì)胞的應(yīng)用前景和所面臨的挑戰(zhàn)。一、什么是ES細(xì)胞一般來講，ES細(xì)胞是指從早期的囊胚中的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（innercellmass,ICM)分離得到的具有無限增殖能力和多分化潛能的一類干細(xì)胞。兩個(gè)重要特性：（1）多潛能性分化，可分化成三胚層以內(nèi)的所有細(xì)胞。（2）可無限的保持未分化狀態(tài)，擴(kuò)增傳代。二、胚胎干細(xì)胞研究的進(jìn)展情況：1981年，Evans和Martin分別成功的分離和體外培養(yǎng)了小鼠的胚胎干細(xì)胞。1995年，Thomson等人分離建立了第一株靈長類動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞。1998年，Thomson等建立了第一株人類胚胎干細(xì)胞。1998年，Shamblott等建立了第一株人類生殖干細(xì)胞。2006年，Yamanaka建立誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（inducedpluripotentstemcell,IPS）

胚胎干細(xì)胞系的建立過程分離囊胚的內(nèi)細(xì)胞群IPS與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，ES細(xì)胞非分化增殖分離胚胎生殖腺脊細(xì)胞

------胚胎干細(xì)胞的鑒定------定向誘導(dǎo)分化-------成體干細(xì)胞-----功能細(xì)胞ES細(xì)胞培養(yǎng)過程ES與EG細(xì)胞ES細(xì)胞培養(yǎng)過程IPS三、ES細(xì)胞的細(xì)胞特性1、細(xì)胞形態(tài)：與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，胞體體積小，核大，有一個(gè)或多個(gè)核仁，核仁清晰，多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)簡單，散布大量核糖體和線粒體。核型正常，具有穩(wěn)定的整倍體核型。

三、ES細(xì)胞的細(xì)胞特性2、生長特性：

ES細(xì)胞在體外分化抑制培養(yǎng)時(shí)，呈克隆狀生長，細(xì)胞緊密的聚集在一起，圓形或卵圓形，細(xì)胞均呈單層或多層緊密堆積，形成島狀或巢狀的群體細(xì)胞克隆，細(xì)胞之間的界限不清，克隆周圍可見單個(gè)ESC和分化的扁平狀上皮細(xì)胞。四、ES細(xì)胞的分子生物學(xué)標(biāo)志1、堿性磷酸酶（AKP）ES細(xì)胞含有豐富的堿性磷酸酶，活性高。但在已經(jīng)分化的ES細(xì)胞中堿性磷酸酶則呈弱陽性或陰性，因此常作為ES細(xì)胞鑒別和區(qū)分ES細(xì)胞分化與否的重要標(biāo)志之一。2、端粒酶ES細(xì)胞表現(xiàn)出高水平的端粒酶活性，不同于正常的二倍體細(xì)胞，可能是其復(fù)制生命期限遠(yuǎn)比體細(xì)胞長的原因。研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶的減少是細(xì)胞衰老的重要機(jī)制之一，但在ES細(xì)胞、生殖細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，端粒酶呈高水平表達(dá)，具有高活性，在細(xì)胞每次分裂之后，可保持端粒長度，進(jìn)而維持細(xì)胞的長期存活。四、ES細(xì)胞的分子生物學(xué)標(biāo)志3、胚胎階段特異性表面抗原（SSEA）

SSEA是一種糖蛋白，常表達(dá)于胚胎發(fā)育早期的細(xì)胞，ES細(xì)胞中SSEA表達(dá)陽性，可作為ES細(xì)胞的標(biāo)記分子之一，用于鑒別。然而，不同種屬的動(dòng)物，其表面抗原組成并不完全一致。五、ES細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

當(dāng)鑒別一株細(xì)胞是不是ES細(xì)胞時(shí)，除了要經(jīng)過以上的檢測：形態(tài)和生長特性，染色體核型分析，特異性表面抗原等。更重要的是要看其是否具有多分化潛能。ESC的誘導(dǎo)分化一般可分為：（1）體外誘導(dǎo)分化（2）定向誘導(dǎo)分化（3）體內(nèi)分化五、ES細(xì)胞的誘導(dǎo)分化干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的常用方法：（1）加入誘導(dǎo)細(xì)胞分化的因子或化學(xué)物質(zhì)，如VGEF、bFGF、DMSO和RA等。（2）將ES細(xì)胞與特定的細(xì)胞共培養(yǎng)。（3）將某種分化誘導(dǎo)因子的基因轉(zhuǎn)入ES細(xì)胞內(nèi)。

五、ES細(xì)胞的誘導(dǎo)分化（1）體外誘導(dǎo)分化：其又可分為兩種：去除抑制因子的細(xì)胞單層培養(yǎng)法。將ESC消化后不貼壁的懸浮或懸滴培養(yǎng)法：可形成EB，其在體外可誘導(dǎo)分化成各類細(xì)胞。常用的誘導(dǎo)劑：維甲酸（RA）、二甲基亞砜（DMSO）和環(huán)六甲基雙乙胺（HMBA）等。五、ES細(xì)胞的誘導(dǎo)分化（1）定向誘導(dǎo)分化：例如，ESC在含DIA的條件培養(yǎng)基中呈未分化生長，去除DIA后，細(xì)胞則向中胚層分化，而在DIA和RA同時(shí)存在時(shí)，ESC可被誘導(dǎo)分化成體壁細(xì)胞。ESC在高密度條件下生長時(shí)，可分化成多種不同類型的細(xì)胞，而在低密度條件下生長時(shí)，則只是分化成少數(shù)幾種類型細(xì)胞。五、ES細(xì)胞的誘導(dǎo)分化（4）嵌合體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：參與宿主胚胎發(fā)育，并形成嵌合體動(dòng)物，包括生殖系嵌合體后代，是ESC的最基本特征。五、ES細(xì)胞的誘導(dǎo)分化（4）嵌合體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：ESC與正常胚胎嵌合，如能產(chǎn)生包括生殖系在內(nèi)的各個(gè)組織器官，且能長生功能性配子的嵌合體（種系嵌合體），則可證實(shí)所分離得到的是具有發(fā)育全能性的ES細(xì)胞系。嵌合體實(shí)驗(yàn)通常有兩種方法：胚胎聚集法。顯微注射法。BALB/C-C57胚胎嵌合體小鼠六、ES細(xì)胞的應(yīng)用

人體發(fā)生過程：受精卵裂受精后72h受精后5-7天精子+卵子

合子卵裂球桑椹胚囊胚滋養(yǎng)層胎盤及胎兒附屬結(jié)構(gòu)囊胚內(nèi)胚層消化道、呼吸道上皮和腺體；肝；膽；胰。內(nèi)細(xì)胞群中胚層結(jié)締組織；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系統(tǒng)外胚層體表結(jié)構(gòu)；神經(jīng)系統(tǒng)六、ES細(xì)胞的應(yīng)用七、ES細(xì)胞研究所面臨的挑戰(zhàn)和前景存在問題：技術(shù)問題：基因機(jī)制不清，誘導(dǎo)分化不純，移植不理想。安全性問題：腫瘤性倫理問題：全球性大討論倫理問題ES細(xì)胞研究涉及到人類胚胎、生命的權(quán)利、器官再造等一系列倫理學(xué)、宗教等敏感問題，使其一直為宗教和人權(quán)等組織所反對。美國有7個(gè)州禁止任何形式的克隆人行為，11個(gè)州立法抵制胚胎干細(xì)胞研究。布什政府在，2001年批準(zhǔn)聯(lián)邦財(cái)政可以支持政府批準(zhǔn)的干細(xì)胞系研究。ES