核酸的物理化學(xué)性質(zhì)課件

第15章核酸物理化學(xué)性質(zhì)NucleicAcid一、核酸的水解

核酸可被水解的位點(diǎn)有磷酸酯鍵和糖苷鍵，其中糖苷鍵更易被水解。

5′端3′端CGA核酸的堿水解

RNA的磷酸酯鍵易被堿水解，產(chǎn)生核苷酸。DNA的磷酸酯鍵則不易被堿水解。這是因?yàn)镽NA的核糖上有2’－OH，在堿作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯極不穩(wěn)定，隨即水解，產(chǎn)生核苷2’，3’－環(huán)磷酸酯。該環(huán)磷酸酯繼續(xù)水解產(chǎn)生2’－核苷酸和3’－核苷酸。

DNA一般對(duì)堿穩(wěn)定，若在1mol/LNaOH中加熱至100℃4h，可以得到小分子的寡聚脫氧核苷酸。核酸的酶水解

水解核酸的酶種類很多。非特異性水解磷酸二酯鍵的酶為磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。專一水解核酸的磷酸二酯酶稱為核酸酶。另外還有非特異水解糖苷鍵的糖苷酶。

核酸酶的分類Ⅰ按底物專一性分類：作用于RNA的稱為RNA酶（ribonuclease，RNase）；作用于DNA的稱為DNA酶（deoxyribonuclease，DNase）。按對(duì)底物作用的方式可分為核酸內(nèi)切酶（endonuclease）和核酸外切酶（exonuclease）。少數(shù)核酸酶既可內(nèi)切又可外切。二、核酸的酸堿性質(zhì)具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)能發(fā)生酮式/烯醇式、氨式/亞氨式互變嘌呤和嘧啶堿基都具有弱堿性______主要是環(huán)內(nèi)氨基的貢獻(xiàn)1、堿基的解離

胞嘧啶中尿嘧啶及胸腺嘧啶中鳥嘌呤和次黃嘌呤中質(zhì)子則結(jié)合到N7上DNA等電點(diǎn)為4～4.5；RNA等電點(diǎn)為2～2.5三、核酸的紫外吸收

堿基含有共軛雙鍵最大吸收峰260nm左右OD260的應(yīng)用：1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0含雜蛋白及苯酚，降低3.判斷DNA是否變性四、核酸的變性、復(fù)性與雜交(一)核酸的變性（denaturation）

1、DNA的變性：

在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力，使核酸分子高級(jí)結(jié)構(gòu)改變、理化性質(zhì)及生物活性發(fā)生改變。

不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級(jí)結(jié)構(gòu)不變2、變性的實(shí)質(zhì)高溫（一般＞75℃）—熱變性強(qiáng)酸、堿—酸堿變性甲醛（Agarose中RNA）尿素（PAGE中DNA）3、變性因素

OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸堿滴定曲線改變 生物活性喪失4、變性后理化性質(zhì)變化RNA變性：從螺旋到線團(tuán)之間的轉(zhuǎn)變RNA的變性引起的性質(zhì)變化沒有DNA明顯DNA變性5、DNA熱變性的特征變性過程是“躍變式”的，而非漸變解鏈曲線：連續(xù)加熱DNA，以溫度對(duì)A260作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。（1）DNA的均一性：（2）G－C含量：

經(jīng)驗(yàn)公式：XG+C＝（Tm－69.3）×2.44（3）介質(zhì)中的離子強(qiáng)度：

Tm值大小與下列因素有關(guān)：(二)核酸的復(fù)性（renaturation）變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈重新締合成雙鏈——復(fù)性。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火(annealing)。DNA復(fù)性分子量越大復(fù)性越難；濃度越大，復(fù)性越容易；DNA復(fù)性也與它本身組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)（具有很多重復(fù)序列DNA，復(fù)性快）。減色效應(yīng)（低色效應(yīng)）——復(fù)性時(shí)紫外吸收減少的現(xiàn)象(三)