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文檔簡介

高通量篩選技術(shù)Highthroughputscreening王陶2012年2月

高通量篩選最初是伴隨組合化學(xué)而產(chǎn)生的一種藥物篩選方式。

1990年末,組合化學(xué)的出現(xiàn)改變了人類獲取新化合物的方式,人們可以通過較少的步驟、在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)合成大量化合物,在這樣的背景下高通量篩選的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

高通量篩選技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)對大量候選化合物完成篩選,經(jīng)過近十年的發(fā)展,已經(jīng)成為比較成熟的技術(shù),不僅僅應(yīng)用于對組合化學(xué)庫的化合物篩選,還更多地應(yīng)用于對現(xiàn)有化合物庫的篩選。

目前世界各大藥物生產(chǎn)商都建立有自己的化合物庫和高通量篩選機(jī)構(gòu),對有潛力形成藥物的化合物進(jìn)行篦梳式的篩選。我國藥物高通量篩選起步較晚,且不規(guī)范,僅有十多年的研究歷史。1996年中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院引進(jìn)國內(nèi)第一臺(tái)Bionek2000型實(shí)驗(yàn)自動(dòng)化工作站;1998年又引進(jìn)全國第一臺(tái)Topcount微量閃爍計(jì)數(shù)器,使放射配基實(shí)驗(yàn)、放射免疫實(shí)驗(yàn)等技術(shù)微量化、自動(dòng)化。上海藥物研究所、北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院分別成立了藥物篩選專門機(jī)構(gòu),開始從事大規(guī)模篩選工作。西安交通大學(xué)藥學(xué)院賀浪沖教授首創(chuàng)的細(xì)胞膜色譜(CMC)為化合物的體外高通量篩選提供了高選擇性、高特異性、高效率的篩選手段。CMC已成功用于鈣離子拮抗劑受體配體結(jié)合反應(yīng)的研究,目前正在進(jìn)行心血管化學(xué)合成藥物的高通量篩選和中藥有效部位及有效成分的尋找。今年將建立CMC自動(dòng)化篩選體系,促進(jìn)我國藥物高通量篩選技術(shù)的全面發(fā)展。高通量細(xì)胞篩選技術(shù)(high-throughputcell-basedscreeningtechnology)是以高通量方式研究基因功能最有效的方法之一。通常,基因功能的初步篩選在96孔或384孔板上進(jìn)行,通過基因轉(zhuǎn)染將候選基因?qū)爰?xì)胞,或直接將基因表達(dá)產(chǎn)物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。

是20世紀(jì)80年代后期發(fā)展起來的一種篩選新技術(shù)。它集計(jì)算機(jī)控制、自動(dòng)化操作、高靈敏度檢測、數(shù)據(jù)結(jié)果自動(dòng)采集和處理于一體,實(shí)現(xiàn)了篩選的快速、微量、靈敏和大規(guī)律,日篩選量達(dá)到數(shù)萬甚至數(shù)十萬樣品次,是篩選技術(shù)和方法的一大進(jìn)步。

篩選測定方法基于要研究的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)問題,例如,要研究抗血管生成活性,選用內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長、分化、遷移和粘附等分析測定;研究免疫調(diào)節(jié)活性,可選擇淋巴細(xì)胞或造血細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長和分化的分析測定;研究神經(jīng)營養(yǎng)因子活性,可選用神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞存活、突起生長測定。除上述與細(xì)胞表型或形態(tài)學(xué)相關(guān)的檢測指標(biāo)外,細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、糖代謝、能量產(chǎn)生和代謝產(chǎn)物分析(metaboliccontrolanalysis)等代謝通路也是基因功能重要的研究內(nèi)容。

結(jié)合抗體芯片技術(shù)、多路測定技術(shù)(multiplexing)等新的檢測方法,高通量細(xì)胞篩選的應(yīng)用更為廣泛。另外,隨著熒光成像讀板儀(fluorescenceimageplatereader,FLIPR)、定量PCR、高通量熒光激活細(xì)胞分類器(HT-FACS)等檢測方法和技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用,靈敏度和重現(xiàn)性這兩個(gè)高通量細(xì)胞篩選的關(guān)鍵問題也逐步得以解決。Boekel微孔板振蕩器的特點(diǎn)

獨(dú)立設(shè)定溫度,振蕩速度和混合時(shí)間;

混勻器可以編程設(shè)定運(yùn)行一定時(shí)間或者瞬時(shí)混合3秒;

內(nèi)置的蓋可以減少污染,樣品揮發(fā)或者噪音的危險(xiǎn)。

多通道移液器連續(xù)移液器一次性吸取大量液體,然后每次按動(dòng)按鈕,僅僅釋放小量等體積的液體。大量液體進(jìn)行等體積分裝多功能酶標(biāo)儀(多功能微孔板檢測儀)微孔板檢測設(shè)備之一,集成4大功能模塊,可進(jìn)行放射性/非放射性檢測。

流式細(xì)胞儀C6流式細(xì)胞儀系統(tǒng)是一種全功能、雙激光、六探測器的流式細(xì)胞儀分析系統(tǒng),C6流式細(xì)胞儀系統(tǒng)的探測器不但可靈敏的捕獲前散射光和旁散射光,還有四個(gè)可調(diào)光學(xué)濾光片的熒光探測器。CFlow操作軟件使搜集數(shù)據(jù)和分析變的簡單快速。高集成度、高度自動(dòng)化的主機(jī),以及優(yōu)良人機(jī)界面、操作簡便的CFlow軟件系統(tǒng)

高通量平行合成儀液相芯片檢測儀微孔過濾板12通道藥物篩選儀條形碼技術(shù)

條形碼(barcode)是將寬度不等的多個(gè)黑條和空白,按照一定的編碼規(guī)則排列,用以表達(dá)一組信息的圖形標(biāo)識(shí)符。常見的條形碼是由反射率相差很大的黑條(簡稱條)和白條(簡稱空)排成的平行線圖案。條形碼可以標(biāo)出物品的生產(chǎn)國、制造廠家、商品名稱、生產(chǎn)日期、圖書分類號(hào)、郵件起止地點(diǎn)、類別、日期等許多信息,因而在商品流通、圖書管理、郵政管理、銀行系統(tǒng)等許多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)SAS(StatisticalAnalysisSystem,統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng))是當(dāng)今國際最著名的數(shù)據(jù)分析軟件系統(tǒng)。SAS:數(shù)據(jù)的輸入輸出和整理、描述性統(tǒng)計(jì)、假設(shè)檢驗(yàn)、圖形的制作、回歸分析、多元統(tǒng)計(jì)分析、方差分析、協(xié)方差分析和時(shí)間序列分析等。數(shù)據(jù)訪問,數(shù)據(jù)管理,數(shù)據(jù)呈現(xiàn),數(shù)據(jù)分析SPSSEXCEL二、高通量篩選技術(shù)常用方法微孔板的使用和光學(xué)檢測法工程菌株的裂解報(bào)告基因流式細(xì)胞技術(shù)蛋白質(zhì)芯片通過發(fā)射光的比率可以推出未知成分的濃度,因此測定化學(xué)反應(yīng)過程中的發(fā)射光是非常有用的。反應(yīng)過程中產(chǎn)生的光與發(fā)射光的量產(chǎn)率是直接相關(guān)的,相應(yīng)的,與發(fā)光物質(zhì)的濃度成比例。因此,反應(yīng)過程中的光可以相對反映出目標(biāo)樣品中發(fā)光物質(zhì)的量?;瘜W(xué)發(fā)光儀使用范圍·ATP(三磷酸腺甙)檢驗(yàn)、熒光素酶檢驗(yàn)·免疫及proteomics·核酸,DNA及基因組·病毒研究(比如:SARS、禽流感病毒研究)·臨床診斷研究·染色體分析·毒性試驗(yàn)·細(xì)胞活力試驗(yàn)·餐館衛(wèi)生檢測·環(huán)境檢測·工業(yè)、農(nóng)林業(yè)、畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)等其它用途最廣泛的用途是對利用報(bào)告基因檢測目標(biāo)基因的表達(dá)以及檢測細(xì)胞內(nèi)ATP水平。微生物污染檢測ATP的發(fā)光檢測方法可以檢測樣品中的所有微生物,因而被用于檢測水中的大腸桿菌含量,包括飲用水和用于oilfieldinjection,coolingsystem以及紙加工過程的工業(yè)用水。ATP的發(fā)光檢測方法還可以用于藥品,化妝品,牛奶以及其它食品的微生物控制。三、高通量篩選的技術(shù)過程1、樣品庫2、初篩和復(fù)篩3、活性化合物4、深入篩選5、獲得少量先導(dǎo)化合物6、確證篩選藥物藥理學(xué)研究7、侯選藥物8、臨床前研究HTS篩選的基本步驟第一步是選擇分子靶。選擇的依據(jù)是來源于國際醫(yī)學(xué)生物學(xué)的新成果。目前國際常用的分子靶有以下幾類:A、細(xì)胞膜受體;B、離子通道蛋白;C、酶蛋白;D、細(xì)胞核受體;E、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。第二步是建立穩(wěn)定表達(dá)分子靶的生物體系。靶是蛋白---克隆相對應(yīng)的蛋白,在大腸桿菌中表達(dá)和提純;靶是細(xì)胞受體---克隆出的基因轉(zhuǎn)化到載體細(xì)胞中,建立穩(wěn)定的細(xì)胞株。第三步建立簡便快速的大規(guī)模的生物檢測方法。根據(jù)靶的不同分為兩類:1、以蛋白等分子為基礎(chǔ);2、以細(xì)胞為基礎(chǔ)酶蛋白---測定酶活性的變化;細(xì)胞膜受體---測定配體-受體的結(jié)合;細(xì)胞核受體---測定蛋白的表達(dá)。在建立大規(guī)模生物檢測方法的同時(shí),要用組合化合物的方法合成大量不同結(jié)構(gòu)的化合物庫相配套。HTS藥物篩選靶點(diǎn)與檢測方法(1)、分子靶點(diǎn)篩選模型---細(xì)胞信號(hào)通路篩選系統(tǒng)外界信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞內(nèi),或者直接穿過細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,最終影響某些基因的轉(zhuǎn)錄。在這個(gè)傳遞過程中,某些特殊的細(xì)胞或一些病理狀況下,可能是其中的一條或幾條通路起作用,藥物可以根據(jù)需要對這些通路進(jìn)行阻斷。使用信號(hào)通路篩選系統(tǒng),可直接對藥物作用的分子機(jī)制有所了解。(2)、細(xì)胞膜表面受體篩選模型

a.G蛋白耦聯(lián)受體:受體與GTP結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白的耦聯(lián),在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生cAMP,從而將外界信號(hào)跨膜傳遞到細(xì)胞內(nèi)。如趨化因子受體、β-受體阻斷劑等。b.催化受體:為單跨膜受體,分為胞外區(qū),跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。當(dāng)細(xì)胞因子與胞外區(qū)結(jié)合后,引起多個(gè)受體單體的聚合,每個(gè)聚合體的受體單體可以是同一類型,也可以不同。如EPO、G-CSF、GH受體2個(gè)同樣的單體;IL-1,GM-CSF,IL-6受體是2個(gè)不同的單體;TNF-α是3個(gè)同樣的單體;IL-2是3個(gè)不同的受體。c.離子通道耦聯(lián)受體:細(xì)胞表面一些神經(jīng)遞質(zhì)的受體,自身是一些離子通道,或者與離子通道相耦聯(lián)。當(dāng)與配體結(jié)合時(shí),受體構(gòu)象改變,通道開放,離子進(jìn)出細(xì)胞,引起電興奮。作業(yè)第四章微生物雜交育種

1、放線菌雜交方法有哪些?簡述每種方法的具體過程?第五章基因工程育種1、簡述基因體外定位誘變的方法。

第六章高通量篩選技術(shù)1、簡述表面展示技術(shù)的方法。2、什么是報(bào)告基因?作為報(bào)告基因,在遺傳選擇和篩選檢測方面應(yīng)具備哪些條件?常見報(bào)告基因有哪些?本課程考核方式寫一篇與微生物遺傳育種相關(guān)的綜述。字?jǐn)?shù)不低于4000字。期末成績=平時(shí)20%+實(shí)驗(yàn)20%+論文60%評(píng)分辦法

課程論文占60%,其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:1)選題新穎(熱點(diǎn)問題的研究、空白問題的探索、老問題的新視野)(10分)2)結(jié)構(gòu)合理、行文流暢、邏輯嚴(yán)謹(jǐn)、學(xué)術(shù)語言規(guī)范(20分)3)觀點(diǎn)鮮明、資料翔實(shí)、立論深刻、有所創(chuàng)新(30分)4)注釋與參考文獻(xiàn)(文獻(xiàn)數(shù)量、種類、外文文獻(xiàn))(10分)5)規(guī)范程度:題目、內(nèi)容提要、關(guān)鍵詞、正文、注釋、參考文獻(xiàn)(20分)6)總結(jié)全文的主要論點(diǎn)和發(fā)展方向,指出目前研究中尚需解決的問題及研究成果的意義和價(jià)值。(10分)7)字?jǐn)?shù)不少于4000字,每少100字扣1分。論文格式要求1、題名(黑體,小三,居中)2、姓名、班級(jí)、學(xué)號(hào)(仿宋、小四、居中)3、摘要:對全文進(jìn)行概括,提出研究目的與意義,論文主要內(nèi)容,150字左右(五號(hào),楷體,首行縮進(jìn)2字符,行距固定值20磅?!罢倍旨哟郑?、關(guān)鍵詞:3~8個(gè)(五號(hào),楷體,首行縮進(jìn)2字符,各關(guān)鍵詞之間加分號(hào);最后一詞之后不加標(biāo)點(diǎn)符號(hào)?!瓣P(guān)鍵詞”三字加粗)5、正文五號(hào)宋體(全文所有西文字體均采用TimesNewRoman),首行縮進(jìn)2字符,行距固定值20磅。6、前言:簡要介紹研究背景,研究現(xiàn)狀(不要與摘要重復(fù))7、正文標(biāo)題采用編碼格式,一級(jí)標(biāo)題加粗,示例如下:

1空間誘發(fā)微生物突變的作用機(jī)制研究2微生物空間誘變的研究與進(jìn)展2.1空間誘變對微生物產(chǎn)酶活性的影響2.2空間誘變對微生物產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物活性的影響

2.3……3問題和展望3.1……9、正文最后要有結(jié)語(或展望)。對全文作總結(jié),可指出目前研究中存在的問題,今后發(fā)展的方向。10、參考文獻(xiàn)格式按照國標(biāo)GB7714-2005《參考文獻(xiàn)著錄規(guī)則》要求。參考文獻(xiàn)不少于10篇。[1]

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