阪崎腸桿菌檢驗(yàn)

阪崎腸桿菌檢驗(yàn)

GB4789.40-2010張秀麗河南省疾病預(yù)防控制中心現(xiàn)在是1頁\一共有36頁\編輯于星期四Enterobactersakazakii(ES)2現(xiàn)在是2頁\一共有36頁\編輯于星期四內(nèi)容第一部分：一般特征第二部分：致病性第三部分：ES的檢驗(yàn)3現(xiàn)在是3頁\一共有36頁\編輯于星期四第一部分：一般特征培養(yǎng)特征生化反應(yīng)抵抗力增殖能力與其他常見腸桿菌相似4現(xiàn)在是4頁\一共有36頁\編輯于星期四一、培養(yǎng)特征

ES在VRBGA平板上首次劃線分離時(shí)，37℃培養(yǎng)24h可生成2種不同的形態(tài)學(xué)特征：干燥或粘液狀、圓鋸齒狀（凹口或鋸齒），用金屬環(huán)接觸時(shí)可發(fā)現(xiàn)堅(jiān)韌或有彈力，即粘貼金屬環(huán)的菌量很少，并且菌落可很快恢復(fù)。傳代培養(yǎng)后可能會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榈湫偷墓饣?。光滑、易于用金屬環(huán)從菌落移取細(xì)胞。 ___國外文獻(xiàn)報(bào)道5現(xiàn)在是5頁\一共有36頁\編輯于星期四本實(shí)驗(yàn)室大多數(shù)分離株呈流蠟樣，粉紫色、圓形、光滑、凸起、飽滿，并散發(fā)出特殊氣味；干燥、頂端發(fā)白的粉紫色菌落；從配方粉中初次分離到的該菌在VRBGA平板上過夜培養(yǎng)后呈現(xiàn)特殊的菌落形態(tài)：菌落干燥、邊緣有褶皺，極富彈性。傳代后，菌落皺褶減少，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，可見皺褶逐漸增加。6現(xiàn)在是6頁\一共有36頁\編輯于星期四二、生化反應(yīng)

特征性生化反應(yīng)結(jié)果D-山梨醇-產(chǎn)生吐溫80脂酶+細(xì)胞外Dnase+氧化酶試驗(yàn)-黃色菌落+α-葡萄糖苷酶+7現(xiàn)在是7頁\一共有36頁\編輯于星期四ES及親緣關(guān)系較近的腸桿菌生化反應(yīng)比較試驗(yàn)生化反應(yīng)1阪崎腸桿菌陰溝腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌成團(tuán)腸桿菌日勾維腸桿菌賴氨酸脫羧酶－－＋－＋精氨酸雙水解酶＋＋－－－鳥氨酸脫羧酶＋＋＋－＋KCN生長(zhǎng)＋＋＋v＋發(fā)酵:蔗糖＋＋＋(＋)＋衛(wèi)矛醇－(－)－(－)－核糖醇－(－)＋－－棉子糖＋＋＋v＋D-山梨醇－＋＋v－χ-甲基-葡萄糖甙＋(＋)－－－D-阿拉伯糖醇－(－)＋－＋黃色素＋－－(＋)－注：＋：90-100％；(＋)：75-89%；V：25-74％；(－)：10-24％；－：0-9％8現(xiàn)在是8頁\一共有36頁\編輯于星期四三、抵抗力耐熱性滲透壓干燥不同菌株的耐熱性存在明顯的差別，但標(biāo)準(zhǔn)的巴氏消毒過程能有效的滅活ES。ES對(duì)滲透壓的耐受性使該菌能夠成為環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)株，增加PIF加工后污染的危險(xiǎn)性，使其在PIF中長(zhǎng)期存活。9現(xiàn)在是9頁\一共有36頁\編輯于星期四四、增殖能力6℃，21℃，37℃分別是13.7h，1.7h，19－21min。MRA發(fā)現(xiàn)，與本底相比，25℃放置6h該菌的相對(duì)危險(xiǎn)性可增加30倍；25℃放置10h可增加30000倍。2004年2月FAO/WHO在日內(nèi)瓦召開的PIF中ES專家研討會(huì)上提出PIF中微量的ES（＜3CFU/100g）污染也能導(dǎo)致感染的發(fā)生。10現(xiàn)在是10頁\一共有36頁\編輯于星期四第二部分：致病性易感人群主要感染渠道配方粉中ES的污染狀況PIF中ES的來源及中毒發(fā)生的原因11現(xiàn)在是11頁\一共有36頁\編輯于星期四一、易感人群嬰兒：腦膜炎壞死性小腸結(jié)腸炎菌血癥嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥高危人群：主要是嬰兒，新生兒、尤其是早產(chǎn)兒、低出生體重等免疫力低下的嬰兒。死亡率：50%，20-50%成人：局部感染、菌血癥、術(shù)后骨髓炎等12現(xiàn)在是12頁\一共有36頁\編輯于星期四二、主要感染渠道?。?！乳品安全標(biāo)準(zhǔn)（報(bào)批稿）《嬰兒配方食品》《特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品》0-6個(gè)月齡13現(xiàn)在是13頁\一共有36頁\編輯于星期四三、配方粉中ES的污染狀況研究樣品腸桿菌（+）ES（+）菌種（%）Muytjens等1980141（MPN/100g）75（51.8%）20（14.2%）E.agglomerans(24.8)E.cloacae(21.3)E.sakazakii(14.2)Iversen和Forsythe200482（25g）7（8.5%）2（2.4%）Pantoeaspp（2.4)E.cloacae(1.2)E.sakazakii(2.4)本試驗(yàn)室2006212（40g）103（48.58%）11（5.19%）Pantoeaspp（11.32）E.cloacae（7.55）E.sakazakii（5.19）產(chǎn)品召回食品、環(huán)境廣泛分布14現(xiàn)在是14頁\一共有36頁\編輯于星期四四、PIF中ES的來源及中毒發(fā)生的原因目前公共衛(wèi)生關(guān)注的PIF中ES的來源包括以下2種情況：內(nèi)在污染——二次污染。

如：加工環(huán)境中微生物的存在；加工裝置內(nèi)表面微生物的存在；熱處理后，與干燥基粉混合的加入成分中存在的微生物。外源性污染——配方粉調(diào)制環(huán)境和調(diào)制器皿。受ES污染的配方粉或調(diào)制配方在較高溫度下存放，食用前不加熱，或加熱不徹底，喂食時(shí)間較長(zhǎng)等都可導(dǎo)致ES有機(jī)會(huì)生長(zhǎng)繁殖，增加患病的危險(xiǎn)性。15現(xiàn)在是15頁\一共有36頁\編輯于星期四

PIF中ES的安全性問題，已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。2002年ICMSF把ES列為“嚴(yán)重危害特殊人群，威脅生命、導(dǎo)致慢性實(shí)質(zhì)性后遺癥或長(zhǎng)期影響”的一種病原菌。2004年2月FAO/WHO在日內(nèi)瓦召開的PIF中ES專家研討會(huì)：ES列為PIF中僅有的兩種A類致病菌（沙門和阪崎）之一。16現(xiàn)在是16頁\一共有36頁\編輯于星期四第三部分

食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)阪崎腸桿菌檢驗(yàn)現(xiàn)在是17頁\一共有36頁\編輯于星期四本標(biāo)準(zhǔn)修改采用ISO/TS22964（1stedition2006-02-01）Milkandmilkproducts—DetectionofEnterobactersakazakiiFDAJuly2002;RevisedAugust2002IsolationandEnumerationofEnterobactersakazakiifromDehydratedPowderedInfantFormula18現(xiàn)在是18頁\一共有36頁\編輯于星期四第一法：阪崎腸桿菌的檢驗(yàn)

第二法：阪崎腸桿菌的計(jì)數(shù)

19現(xiàn)在是19頁\一共有36頁\編輯于星期四第一法

阪崎腸桿菌的檢驗(yàn)20現(xiàn)在是20頁\一共有36頁\編輯于星期四阪崎腸桿菌檢驗(yàn)程序報(bào)告生化鑒定挑取黃色菌落DFI瓊脂36℃±1℃，24h±2h挑取藍(lán)綠色菌落1mL+mLST-Vm10mL44℃±0.5℃，24h±2h檢樣100g/mL+稀釋液900mL36℃±1℃，18h±2h前增菌選擇性增菌選擇性分離生化鑒定TSA25℃±1℃，48h±4h現(xiàn)在是21頁\一共有36頁\編輯于星期四5.1前增菌和增菌BPW（合適時(shí)可選擇無菌水）左圖：未混合；右圖：混合后。22現(xiàn)在是22頁\一共有36頁\編輯于星期四mLST-VmmLST-Vm，即在大腸菌群增菌肉湯LST中另加入適量的NaCl和Vm。研究證明與其他腸桿菌科細(xì)菌（如沙門菌屬、大腸埃希氏菌等）相比，ES具有較高的耐滲透壓能力。加入0.5M的NaCl在保證ES良好生長(zhǎng)的同時(shí)，可以有效地抑制上述其他細(xì)菌的生長(zhǎng)。Vm可有效地抑制G+菌的生長(zhǎng)。而較高的生長(zhǎng)溫度可以進(jìn)一步抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)。23現(xiàn)在是23頁\一共有36頁\編輯于星期四5.2分離顯色培養(yǎng)基的基本原理相似，二者都是根據(jù)ES能產(chǎn)生α-葡萄糖苷酶，分解底物XaGlc產(chǎn)生有色菌落。24現(xiàn)在是24頁\一共有36頁\編輯于星期四顯色培養(yǎng)基對(duì)ES的選擇性較好，ES形成的特征性菌落易于辨認(rèn)，以DFI為例：硫化氫指示劑可以區(qū)分ES和產(chǎn)生少量α-葡萄糖苷酶但H2S陽性菌株（如普通變形桿菌）。ES都可以在該平板上生長(zhǎng)并產(chǎn)生藍(lán)綠色菌落其他常見菌在DFI平板的菌落顏色白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、大腸埃希氏菌、泛菌屬的多種菌等黃色菌落：赫氏埃希氏菌黑褐色、粉色或中心藍(lán)綠菌落：少量菌種ESIA:藍(lán)色，1-3mm國產(chǎn)顯色培養(yǎng)基25現(xiàn)在是25頁\一共有36頁\編輯于星期四36℃±1℃24h±2h26現(xiàn)在是26頁\一共有36頁\編輯于星期四黃色素TSA：25℃培養(yǎng)后典型ES：黃色陰性對(duì)照E.coliATCC25922：白色菌落27現(xiàn)在是27頁\一共有36頁\編輯于星期四5.3鑒定（生化反應(yīng)）生化試驗(yàn)特征黃色素產(chǎn)生＋氧化酶－L-賴氨酸脫羧酶－L-鳥氨酸脫羧酶（＋）L-精氨酸雙水解酶＋檸檬酸水解(＋)發(fā)酵：D-山梨醇（－）L-鼠李糖＋D-蔗糖＋D-蜜二糖＋苦杏仁甙＋注：＋＞99%陽性；－＞99%陰性；（＋）90%－99%陽性；（－）90%-99%陰性。28現(xiàn)在是28頁\一共有36頁\編輯于星期四商業(yè)生化鑒定系統(tǒng)的應(yīng)用推薦使用的ES生化鑒定方法有很多，主要有API20E，ID32E，BiologGN2MicroPlate，VITEKGNI+等。上述方法都比較成熟，穩(wěn)定性較好，已被許多國家和組織的標(biāo)準(zhǔn)采用。在腸桿菌的生化鑒定中使用最廣泛的是API20E和VitekGNI+。29現(xiàn)在是29頁\一共有36頁\編輯于星期四API20E生化鑒定板典型生化反應(yīng)圖示API20E反應(yīng)編碼API20E結(jié)果評(píng)價(jià)3345373Excellentidentification3305173Excellentidentification3305363Verygoodidentification3305373GoodidentificationAcceptableidentification？VITEK30現(xiàn)在是30頁\一共有36頁\編輯于星期四質(zhì)量控制選擇近期分離的阪崎腸桿菌陽性菌株或標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽性對(duì)照，檢測(cè)增菌液和分離培養(yǎng)基對(duì)阪崎腸桿菌生長(zhǎng)的影響和生化鑒定結(jié)果，對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的操作過程進(jìn)行質(zhì)量控制。31現(xiàn)在是31頁\一共有36頁\編輯于星期四阪崎腸桿菌檢測(cè)方法的比較2005年從10個(gè)?。ㄊ校┑牧闶刍蚺l(fā)市場(chǎng)采集的194份配方粉。FDA定性檢測(cè)檢出4個(gè)陽性樣本，本定性檢測(cè)檢出5個(gè)，其中4個(gè)在第一法的檢測(cè)中均為陽性，另一陽性檢出樣品在第一法中的檢測(cè)結(jié)果為陰性。*“粉紫色、圓形、光滑、凸起、飽滿”。選擇性分離平板上分離株的菌落特征和樣品數(shù)量VRBGADFI菌落特征樣品數(shù)量

菌落特征樣品數(shù)量無任何菌落生長(zhǎng)14無任何菌落生長(zhǎng)163直徑<1mm的菌落1371種藍(lán)綠色菌落52種菌落61種白色菌落22典型菌落*5（3）白色菌落和藍(lán)綠色菌落各1種31種非典型菌落32（1）1種白色菌落但略顯淡綠1合計(jì)194

合計(jì)19432現(xiàn)在是32頁\一共有36頁\編輯于星期四第二法

阪崎腸桿菌的計(jì)