雙向電泳原理與流程

雙向電泳原理與流程第1頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六Proteomics“...theanalysisofcompletecomplementofproteins.

Proteomicsincludesnotonlytheidentificationandquantificationofproteins,butalsothedeterminationoftheirlocalization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,theirfunction."StanleyFields,UniversityofWashington,Seattle,inScience[291,1221(2001)]第2頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六Proteomics一個細胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達的所有種類的蛋白質(zhì)稱為蛋白質(zhì)組(proteome)僅僅從基因組學水平上無法徹底的了解各種生命現(xiàn)象,因為蛋白質(zhì)才是生命活動的真正執(zhí)行者

從基因組學上我們無法檢測到轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯調(diào)節(jié)、選擇性剪切、以及蛋白復合物形成、蛋白質(zhì)相互作用等生命現(xiàn)象;此外并不是細胞內(nèi)的所有的DNA都翻譯轉(zhuǎn)錄成蛋白質(zhì)第3頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六ProteomeAnalysisandProteomics"TheanalysisoftheentirePROTEincomplementexpressedbyagenOME,orbyacellortissuetype."WasingerVCetal,Electrophoresis16(1995)“Proteomicsisthestudyofquantitativechangesofexpressionlevelsandtheirapplicationtodrugdiscovery,diagnosticsandtherapy.”Twobasictechnologies:2-DelectrophoresisofcomplexproteinmixturesIdentificationandstructureanalysisofproteinswithmassspectrometrymethods第4頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六Why2DE?Only“Proteomics”isthelarge-scalescreeningoftheproteinsofacell,organismorbiologicalfluid,aprocesswhichrequiresstringentlycontrolledstepsofsamplepreparation,2-Delectrophoresis,imagedetectionandanalysis,spotidentification,anddatabasesearches.Thecoretechnologyofproteomicsis2-DE.Atpresent,thereisnoothertechniquethatiscapableofsimultaneouslyresolvingthousandsofproteinsinoneseparationprocedure.第5頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六理論pIandMr

圖

酵母細胞表達6,216種蛋白pI(理論值)Mr[kDa]2DE工作范圍注:圖片中沒有特別強調(diào)蛋白豐度和疏水性至今1,484個蛋白被鑒定

(Nat.Biotechnol.17,676and19,242)From:Wildgruberetal.Electrophoresis21(2000)2610-2616.第6頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六2D電泳優(yōu)越性對未處理樣本耐受性好不需要預純化(如：色譜層析)分辨率非常高2D可以有效的組分收集器蛋白在凝膠介質(zhì)中受到保護在蛋白質(zhì)組學技術(shù)中應(yīng)用范圍最廣（front-end）與其他技術(shù)相比，在一次試驗中可檢測到的蛋白點更多

與后續(xù)分析技術(shù)兼容性好(如.MDLC)第7頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六蛋白質(zhì)組學應(yīng)用舉例研究細胞結(jié)果功能和分子組成發(fā)現(xiàn)新的藥物靶位點發(fā)現(xiàn)新型生物學活性的分子和藥物差異蛋白質(zhì)組學發(fā)現(xiàn)細菌、病毒感染和疾病監(jiān)測的分子標志物修飾蛋白質(zhì)組學遺傳或藥理學擾動的分子解剖病理生理學研究中藥機理相互作用蛋白質(zhì)組學研究藥物作用方式和毒性機理植物抗蟲抗旱抗逆遺傳育種和分子育種資源環(huán)境海洋生物第8頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六尋找差異蛋白質(zhì)環(huán)孢素A處理前環(huán)孢素A處理后正常組織腫瘤組織細胞組織第9頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六LifeSciences的歷史LKB

——電泳發(fā)明者Pharmacia

——層析技術(shù)開創(chuàng)者AmershamBiosciences

——提供基因組、蛋白組學研究整體解決方案GEHealthcareLifeSciences

——實現(xiàn)從發(fā)現(xiàn)到功能研究，從體外到體內(nèi)的突破 第10頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六GEHealthcaremilestonesin2-DelectrophoresisLKBintroducedAmpholine?,thefirstcommercialcarrierampholyteThefirstmultipleseparationsystem,ISO-DALT,wasdevelopedPharmaciaFineChemicalsintroducedPharmalyte?LKBintroducedImmobiline?PharmaciaBiotechintroducedImmobilineDryStripPharmaciaBiotechintroducedImageMaster?suitePharmaciaBiotechintroducedIPGphor?PharmaciaBiotechlaunchedDALTIIsystemAmershamPharmaciaBiotechlaunchedTyphoon?AmershamBioscienceslaunchedEttan?DIGE

TheMultiphor?flatbedelectrophoresisunitislaunched.Inproductionfor30yearsin2003!19671978197919821991199319982000200020021973第11頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六第12頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六ImageanalysisImageacquisitionAutomatedspotpickingSpotdigestionMALDItargetspottingLWSLaboratoryworkflowsystemMALDI-ToFProteinSeparationProteomics2DEWorkflowSamplePrepSamplelabeling第13頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六

小鼠肝臟蛋白提取物2D凝膠電泳2-DelectrophoresisgelfromProf.Dr.A.G?rg,TechnicalUniversityMunich,Germany第14頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六2D/MS經(jīng)典工作流程細胞裂解勻漿預分級除雜質(zhì)濃縮定量差異分析雙向電泳第一向第二向圖像獲取圖譜分析銀染

考染熒光蛋白標記樣品制備分離染色圖譜分析挖點酶解點靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細胞第15頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六樣品制備細胞破碎蛋白沉淀溶解抑制蛋白酶活性去除

核酸

脂類

鹽，緩沖液，離子性小分子

不溶性物質(zhì)第16頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六2D/MS經(jīng)典工作流程差異分析圖像獲取圖譜分析銀染

考染熒光蛋白標記染色圖譜分析挖點酶解點靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細胞Separation雙向電泳第一向第二向細胞裂解勻漿預分級除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備第17頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六Principleof2-DElectrophoresis1.Firstdimension:

denaturingisoelectricfocusing

separationaccordingtothe

isoelectricpoint2.Seconddimension:

SDSelectrophoresis

separationaccordingtothe

molecularweight

2-Delectrophoresisresolvesafewthousandproteinspots.第18頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六等電聚焦電泳原理蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負電荷的數(shù)量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化。第19頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六

等電聚焦（IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)，從而構(gòu)成從正極到負極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場的作用下運動，最后各自停留在其等電點的位置上，測出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點。等電聚焦電泳原理第20頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六雙向電泳：傳統(tǒng)方法sample膠在SDS緩沖液中平衡PrincipleaccordingtoP.H.O’FarrellandJ.Klose(1975)pH10pH10pH3pH3垂直膠管中進行等電聚焦urea,NP-40一向:二向:SDS丙烯酰胺凝膠電泳非連續(xù)梯度膠按等電點分離（電荷）按分子量分離（質(zhì)量）第21頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六使用載體兩性電解質(zhì)IEF時存在的問題不同批次載體兩性電解質(zhì)的重現(xiàn)性載體兩性電解質(zhì)梯度不穩(wěn)定蛋白載量有限重現(xiàn)性差導致梯度漂移梯度漂移導致酸性和堿性蛋白質(zhì)丟失管膠柔軟，尺寸不定操作者個人技術(shù)影響結(jié)果第22頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六固相凝膠(支持膜上0.5mm厚凝膠)丙烯酰胺緩沖液:Immobiline?

CH2=CH-CO-NH-R,R：羧基或叔胺基固相pH梯度(IPG)第23頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六Immobiline?

干膠條的特性可重復性無梯度漂移,真正的平衡方法可分離酸性和堿性蛋白

容納蛋白樣本量更多水平和垂直SDS凝膠中都能使用允許樣本水化上樣機械強度和尺寸穩(wěn)定易操作易于對樣本跟蹤標記第24頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六新pH范圍的Immobiline干膠條高分辨率的IPG膠條，聯(lián)合使用DeStreak試劑,能改善極堿性區(qū)域蛋白點結(jié)果 。歸功于獨特的試劑。 使用pH范圍相互重疊的干膠條，可提高2-D圖譜分析效率!新pH范圍:

Immobiline?DryStrippH3–5.6NLImmobilineDryStrippH5.3–6.5ImmobilineDryStrippH6.2–7.5ImmobilineDryStrippH7–11NLImmobilineDryStrippH3–11NL第25頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六不同pH范圍膠條不同長度、多種窄pH范圍膠條可選，尤其是1個pH范圍pH7-11NL堿性膠條第26頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六寬pH、窄pH范圍膠條寬pH梯度膠條應(yīng)用:

整個蛋白圖譜窄

pH梯度膠條應(yīng)用:

提高分辨率

增加樣品上樣量

檢測分析更多蛋白pH345678910456789第27頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六提高分辨率:斑點顯現(xiàn)IPG4-7IPG5-6IPG4-7IPG5.5-6.7MouseliverproteinsFromA.G?rgetal.(1999)第28頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六不同長度的膠條7cm11cm13cm18cm24cm第29頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六線形與非線形膠條formostsamples

Celllysates Tissueextracts linear(L)nonlinear(NL)forsampleswithabundantproteinsintherangebetweenpH5and7Serumproteins第30頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六pH3-10LandNLfromProf.AngelikaG?rg,TechnicalUniversityMunichTissueProteinsfromMouseLiverlinear(L)nonlinear(NL)第31頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六TheIPGphor?Platform第32頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六IPG膠條水化第33頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六IPGstriprehydration如果水化時加入樣品，此體積是加入樣品后的終體積第34頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六加樣品到膠條槽第35頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六泡漲盤VS聚焦盤第36頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六干膠條的水化主動水化：膠條槽內(nèi)進行，大分子蛋白更容易進入膠條；30－120V，10－24Hrs被動水化：專用水化盒中進行NEW！無需覆蓋油！避免灰塵污染，空氣作用不透明蓋子，適用于CyDyeDIGE標記同時適用于市場上所有7－24cm干膠條的水化第37頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六在樣品杯中加入少量不含樣品的水化液檢查是否漏液。上樣前吸走水化液。上樣前將樣品離心去掉不溶物，每個樣品杯最多可加樣150μl。蓋上膠條槽的蓋子，再蓋IPGphor儀器的蓋子。分別將兩個IEF電極片放在IPG膠條膠的兩端，分別將電極壓在兩個電極片的外緣。樣品杯可放在兩個電極間除膠條槽內(nèi)側(cè)凸起外任何位置，對于堿性分離范圍的IPG膠條，盡量將樣品杯靠近陽極放置.杯上樣&紙橋上樣第38頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六IEF電泳IPGphor包括半導體溫控系統(tǒng)(20°C)和程序化電源(10000V)可同時進行12根膠條的等電聚焦聚焦效果以“Vh”數(shù)控制，可提高重復性第39頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六IPG膠條的平衡——兩步平衡SDS電泳前,平衡母液: 2%SDS,50mMTris-HClpH8.8,

6Murea,30%glycerol+

蛋白與SDS結(jié)合甘油和尿素降低電內(nèi)滲作用第一步DTT平衡：(1x15min)1%DTT

第二步碘乙酰胺平衡：去除多余的DTT，防止拖尾(1x15min)2.5%iodoacetamide第40頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六第二向垂直電泳系統(tǒng)

瓊脂糖覆蓋密封

放置IPGstrip低熔點瓊脂糖第41頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六PushtheIPGStripDownontotheGelSurface第42頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六SealtheCassetteandFixtheIPGStripwithAgarose第43頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六InsertingtheCassette第44頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六SDS參數(shù)第45頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六SE600ruby第46頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六EttanDALTsix第47頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六EttanDALTtwelvesystem第48頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六第二向系統(tǒng)

strip gel number running length(cm) size(cm) ofgels time(hr)EttanDalt12 18,24 25x20 12 4.5EttanDalt6

18,24 25x20 6 4.5SE600 2x7,13 14x16(24) 4 4MiniVE 7 8x7,8x10 2 1.5MultiphorII 7,11 24x11* 1 1.5 18 24x18 1 3.3PhastSystem (4)** 4x4 2 0.5

*2or3stripsside-by-side **cutorhome-madestrip第49頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六2D/MS經(jīng)典工作流程差異分析圖像獲取圖譜分析蛋白標記圖譜分析挖點酶解點靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細胞分離細胞裂解勻漿預分級除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備雙向電泳第一向第二向銀染

考染熒光染色第50頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六ProteinDetectionMethods

第51頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六Coomassie?Blue-考馬斯亮藍染色+靈敏度，低至0.01mg(“膠體”考染)+非特異性染色+染料與蛋白成比例結(jié)合+線性化好擴散速度受限，膠的厚度影響跑膠速度純度不夠有限的動力學范圍第52頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六膠體考馬斯亮藍染色1mgE.colistrainBIPGphor

24cmpH4-7ColloidalCBB

G250staining第53頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六銀染+靈敏度，低至0.2ng+在凝膠基質(zhì)中與蛋白交聯(lián)+自動催化反應(yīng)染凝膠表面蛋白

線性化程度比考染低一些大分子物質(zhì)也被染色

步驟多，某些步驟時間控制嚴格第54頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六SilverstainedgelofE.coliLysate

IPG4-7SilverstainedwithPlusOne?KitwithoutglutaraldehydeandformaldehydeintheAgsol.第55頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六2D/MS經(jīng)典工作流程差異分析蛋白標記挖點酶解點靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細胞分離細胞裂解勻漿預分級除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備雙向電泳第一向第二向圖像獲取圖譜分析銀染

考染熒光染色圖譜分析第56頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六ImageScannerIII圖像掃描系統(tǒng)灰度校正功能平臺具有防水功能，可直接掃描SDS濕膠。3.7OD高動態(tài)范圍，保證高、低豐度蛋白的準確定量。掃描平臺大，A3掃描面積，一次可掃描2塊24cm凝膠。Gray256scaleTransmissive300dpi第57頁，共65頁，2023年，2月20日，星期六由SIB,GeneBio和GEHealthcare合作開發(fā)，為SwissProt推薦分析軟件。高效能參數(shù)自動找點，全自動蛋白定量計算方法，不受背景影響。在原始數(shù)據(jù)上進行分析，結(jié)果可靠。界面窗口可隨意設(shè)計，界面極其友好。全自動凝膠匹配，采用先進的算法。根據(jù)點的相關(guān)因素、形狀、位置、周圍情況， 膠間匹配效率高。多種統(tǒng)計學分析工具，快速找到膠間蛋白表達差異?？芍苯渔溄拥紼xPASy?

和SwissProt