白血病細胞遺傳學(xué)

白血病細胞遺傳學(xué)第1頁/共32頁

白血病細胞遺傳學(xué)

第2頁/共32頁一、白血病的細胞遺傳學(xué)發(fā)展簡史

雖然早在1914年德國學(xué)者Boveri就提出了染色體畸變是導(dǎo)致腫瘤的基本原因的假說，可是由于受到技術(shù)的限制，長時間以來人類染色體的正確數(shù)目一直無法搞清楚，自然更談不上對腫瘤開展研究了。1956年Tjio和Levan通過人胚胎肺的成纖維細胞培養(yǎng)，終于確定人類染色體的正確數(shù)目為46.這一重要發(fā)現(xiàn)被公認為細胞遺傳學(xué)發(fā)展史上的第一個里程碑。1958年Ford等在一例急性白血病患者的骨髓細胞中發(fā)現(xiàn)有44個染色體和1個斷片的非整倍體異常，標志著白血病染色體研究的開始。1960年Nowell和Hungerford在美國費城發(fā)現(xiàn)了2例慢性粒細胞白血病患者外周血標本中有小的異常染色體，這一發(fā)現(xiàn)迅速為許多其他學(xué)者所證實并將該異常染色體命名為Ph染色體，即費城染色體。這是人類腫瘤中第一個被發(fā)現(xiàn)的標記染色體，它激起了人們對腫瘤染色體研究的巨大熱情，遂被公認為細胞遺傳學(xué)發(fā)展史上的第二個里程碑。第3頁/共32頁

白血病的染色體研究大致經(jīng)歷了以下4個發(fā)展階段：

1、非顯帶時期（1958-1970年）

2、顯帶時期（1970年后）

3、FISH時期（1980年后）

4、多色FISH時期（1990年后)第4頁/共32頁二、白血病的細胞遺傳學(xué)研究的方法（一）標本的來源和采集按照腫瘤染色體研究的標本必須取自腫瘤組織本身的原則，白血病的染色體研究通常以采用骨髓為宜。當外周血白細胞總數(shù)>10x109/L和原、幼細胞百分比>10%時，也可采用外周血細胞進行短期培養(yǎng)。第5頁/共32頁（二）染色體的制備

1、標本采集。用肝素潤濕的針筒抽取骨髓2ml或更多，立即注入含1640培養(yǎng)基的標本瓶中。

2、細胞接種。將標本瓶帶回實驗室后，先做骨髓有核細胞計數(shù)，再按照1~2x106/ml的細胞密度注入標本瓶中，將培養(yǎng)瓶放入37℃溫箱中持續(xù)培養(yǎng)24或48h，其間定時搖勻培養(yǎng)物。

3、阻留中期分裂相。培養(yǎng)瓶中加入秋水仙素，終濃度為0.05ug/ml，搖勻后置37℃溫箱中1h。

4、收獲細胞。將培養(yǎng)物吸至尖底離心管，離心，1000轉(zhuǎn)/min，10min。

5、低滲。棄上清液，沿管壁緩緩加入預(yù)溫至37℃的0.075mol/L的KCl溶液6~8ml，吹打混勻后置37℃溫箱中30min。

第6頁/共32頁6、預(yù)固定。加入3：1甲醇、冰醋酸固定液1ml，吹打混勻。離心，1000轉(zhuǎn)/min，10min。

7、固定。吸去上清液，加新鮮配制的3：1甲醇、冰醋酸固定液6~8ml，吹打混勻。靜置至少30min后，離心，1000轉(zhuǎn)/min，10min。重復(fù)固定三次，后兩次靜置時間至少15min。

8、制片。用吸管將細胞懸液輕輕打勻后吸取少量，從10cm高處滴至冰水浸泡過的玻片上，每片三滴，然后在酒精燈上來回通過數(shù)次，使其干燥。

9、顯帶。將玻片置于預(yù)溫至87.5℃的R顯帶液中孵育，時間以60~120min為宜。

10、染色。標本用10%的Giemsa染色液染色10~20min，流水沖洗，待干，鏡檢。第7頁/共32頁

采集標本

短期培養(yǎng)

加秋水仙素1h

低滲30min

預(yù)固定

固定

制片

顯帶

染色第8頁/共32頁第9頁/共32頁三、白血病染色體畸變的臨床和生物學(xué)意義

（一）克隆性染色體異常的檢出有助于白血病的診斷和鑒別診斷特別是一些特異性染色體的重排不僅有助于AML和ALL的鑒別，而且有助于進一步識別它們中的亞型。1985年國際白血病形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)和細胞遺傳學(xué)分型討論會將特異性染色體的重排和細胞形態(tài)學(xué)特征、免疫學(xué)表型等一起列為白血病診斷分型的重要指標，即以MIC分型代替既往單純以細胞形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的FAB分型。新近世界衛(wèi)生組織WHO提出的直接用特異性染色體易位或免疫表型來命名白血病的亞型，這進一步凸顯出了細胞遺傳學(xué)和免疫學(xué)在白血病診斷分型中的地位和作用。第10頁/共32頁當今WHO分型將AML分為四亞型：

伴有特殊染色體的AML

伴有病態(tài)造血的AML

治療相關(guān)的AML和MDS

不伴特殊細胞遺傳易位的AML

第11頁/共32頁1．伴有特殊細胞遺傳易位的AML

（1）伴有t(8;21)(q22;q22)AML,

AML1（CBFα）/ETO的AML

（2）伴有inv(16)(p13;q22)或

t(16;16)(p13;q22),

CBFβ/MYH11的骨髓嗜酸粒細胞增多的AML

（3）伴有t(15;17)(q22;q11-12),PML/RARα

及變異的急性早幼粒細胞白血病（APL）

（4）伴有11q23(MLL)異常增生的AML

第12頁/共32頁2．伴有多系增生異常的急性髓細胞白血病

（1）有MDS或MDS/MPD病史

（2）發(fā)病前無MDS病史

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3．治療相關(guān)的AML和MDS

（1）與烷化劑相關(guān)

（2）與DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ抑制劑相關(guān)

（一些可以是淋巴系）

（3）其他第14頁/共32頁

4．不伴特殊細胞遺傳易位的AML

（1）未分化AML

（2）未成熟AML

（3）成熟AML

（4）急性粒-單核細胞白血病

（5）急性單核細胞白血病

（6）急性紅白血病

（7）急性巨核細胞白血病

（8）急性嗜堿細胞白血病

（9）伴骨髓纖維化的急性全髓增生

（10）髓細胞肉瘤第15頁/共32頁（二）染色體畸變可作為監(jiān)測急性白血病緩解、復(fù)發(fā)和CML急變的重要指標急性白血病最初的核型異常經(jīng)過治療后完全消失而代之以正常核型提示CR。CR后原有異常重新出現(xiàn)，提示白血病復(fù)發(fā)。除原有異常外，又增添了新的異常，提示發(fā)生了克隆性核型演變，通常意味著疾病的進展如CML加速期或急變期往往在原有的t(9;22)的基礎(chǔ)上出現(xiàn)+ph、+8、+19、

i（17q）、+21等異常。因此病程中反復(fù)多次染色體檢查有助于判斷急白的緩解、復(fù)發(fā)和CML急變。第16頁/共32頁（三）性染色體標志可用來驗證異基因骨髓移植是否成功或確定白血病復(fù)發(fā)的來源（四）染色體是獨立的預(yù)后指標并有助于治療方案的選擇診斷時的核型是急白最有價值的預(yù)后因素，它決定著患者獲得CR的幾率、CR持續(xù)時間和總生存期的長短。根據(jù)核型可將急白患者分為三個不同的預(yù)后亞型第17頁/共32頁

與急白預(yù)后相關(guān)的細胞遺傳學(xué)亞型核型預(yù)后等級

AMLALL低危t(8;21)、t(15;17)、inv(16)>50的超二倍體、t（12；21）正常核型、+8、+21、+22、11q23

中危del(9q)、del(7q)、del(12p)、-y正常核型、6q-、t(10;14)、

t(11;14)高危-5、-7、del（5q）、3q重排、t(9;22)、t(8;14)、t(4;11)、復(fù)雜異常（≥3種異常）亞二倍體/近單倍體第18頁/共32頁

核型對治療方案的選擇也有一定的指導(dǎo)意義，最典型的例子為早幼粒細胞白血病患者若發(fā)現(xiàn)t（15；17）易位或PML-RARa融合基因，則提示將對全反式維甲酸或三氧化二砷治療有良好的反應(yīng)；反之，則療效不佳。t（12；21）易位或高二倍體ALL對左旋門冬酰胺酶和抗代謝藥物為主的化療方案反應(yīng)良好。t（1；19）則需要更強烈的方案方能獲得較好療效。t（4；11）和t（9；22）幾乎總是預(yù)后不良，需要高劑量化療和在首次CR后進行異基因骨髓移植治療。第19頁/共32頁（五）染色體發(fā)現(xiàn)為分子生物學(xué)研究提供了重要線索染色體易位斷裂點的克隆導(dǎo)致一系列與白血病有關(guān)的重要基因被相繼發(fā)現(xiàn)，這不但對于白血病的診斷及其微小殘留病的檢測有很大的應(yīng)用價值，而且對于研究白血病的發(fā)病機制和探索新的治療手段也有重要的理論意義。第20頁/共32頁四、與FAB亞型相關(guān)的特異性染色體重排

（一）t（9；22）（q34;q11）Ph染色體約見于95%的CML患者，通常被認為是CML的重要診斷標志。根據(jù)Ph染色體的有無，可將CML與類白血病反應(yīng)、骨髓增生綜合征及MDS相鑒別。分子生物學(xué)的研究證明，原位于9q34的ABL原癌基因易位到22q11上和BCR基因的一部分融合，產(chǎn)生BCR/ABL融合基因，后者轉(zhuǎn)錄為8.5Kb的BCR/ABL融合mRNA，最終翻譯成210KD的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)具有酪氨酸激酶的活性，它通過包括RAS在內(nèi)的多種信號傳導(dǎo)途徑來活化癌基因和某些細胞因子，最終導(dǎo)致細胞的惡性轉(zhuǎn)化。第21頁/共32頁CML患者經(jīng)過新近問世的BCR/ABL信號傳導(dǎo)抑制劑STI571治療后，100%的患者可獲得完全的血液學(xué)緩解，53%的病例有細胞遺傳學(xué)的反應(yīng)，其中13%為完全的細胞遺傳學(xué)反應(yīng)。（針對易位靶點的研究將在白血病的治療前景中發(fā)揮重要的作用。）

第22頁/共32頁CML急變期，20%的患者保持46，t（9；22）核型不變，80%的患者可發(fā)生核型演變，即出現(xiàn)額外的染色體異常以致染色體眾數(shù)增加至47~50.最多見的額外染色體異常按出現(xiàn)的頻率的高低依次為2Ph、+8、i（17q）、+19和+21。它們可單獨或聯(lián)合出現(xiàn)。染色體的丟失較少見，其中-7約見于3%的患者，多為急淋變。額外異常通常比臨床和血液學(xué)急變征象早出現(xiàn)2~4個月，因此CML病程中定期進行染色體檢測有助于早期診斷CML急變。第23頁/共32頁CMLt(9;22),-Y第24頁/共32頁

（二）t（8；21）（q22;q22）該易位和AML-M2有特別的聯(lián)系（92%為AML-M2，7%為AML-M4，個別為AML-M1）分子生物學(xué)研究揭示該易位導(dǎo)致原位于21q22的AML1基因易位到8q22上和位于該處的ETO基因并置，形成AML1-ETO融合基因。AML1系核心結(jié)合因子（CBF）的a亞單位。正常情況下，它和CBFβ亞單位結(jié)合，形成異二聚體的轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)許多與髓系細胞的生長和分化有關(guān)的基因的表達。AML1-ETO融合基因通過對殘存的正常的CBFa/β轉(zhuǎn)錄因子的顯性負調(diào)控作用，干擾了有關(guān)基因的表達，最終導(dǎo)致細胞的惡性轉(zhuǎn)化。第25頁/共32頁第26頁/共32頁

（三）t（15；17）（q22;q21）該易位只見于早幼粒細胞白血病，即AML-M3。約85%的AML-M3包括粗顆粒型和細顆粒型均可檢出t（15；17），因而成為該型白血病高度特異的細胞遺傳學(xué)標志。分子遺傳學(xué)研究揭示原位于17q上的維甲酸受體a基因（RARa）易位到15q上和位于該處的早幼粒細胞白血病基因（PML）融合，形成PML-RARa融合基因。正常情況下，PML顯示類似腫瘤抑制基因的活性，RARa則有促進分化和抑制生長的活性。PML-RARa融合蛋白既破壞了核體的正常結(jié)構(gòu)，又通過與PML或其他的維甲酸結(jié)合蛋白形成穩(wěn)定的異源二聚體，從而對野生型的PML和RARa等位基因起顯性的負調(diào)控作用，最終導(dǎo)致細胞的惡性轉(zhuǎn)化。

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臨床上凡具有t（15；17）易位或PML-RARa融合基因的AML-M3病例應(yīng)用全反式維甲酸治療有效，反之則無反應(yīng)，表明t（15；17）的有無