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文檔簡介
實驗三超氧化物歧化酶的提取及活性測定第1頁,共11頁,2023年,2月20日,星期六一、目的和要求通過植物材料(玉米)超氧化物歧化酶(SOD)的提取及活性測定,掌握硫酸銨鹽析沉淀蛋白質及超濾濃縮蛋白質的方法和原理。
第2頁,共11頁,2023年,2月20日,星期六二、實驗原理超氧化物歧化酶(SOD)廣泛存在于植物體內,它是一種重要的自由基清除劑,對生物體有多種保護作用。超濾是一種蛋白質濃縮方法,只要選擇適當?shù)臑V膜可將玉米漿中的SOD與其他小分子雜蛋白、可溶性糖等分離。第3頁,共11頁,2023年,2月20日,星期六三、材料與試劑1.材料
玉米籽粒2.主要試劑1、0.05mol/L磷酸緩沖液(pH7.8),500mL2、氯仿-乙醇混合液:氯仿:無水乙醇=3:53、丙酮:用前需預冷至4-10℃4、0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH10.2)5、0.1mol/LEDTA溶液第4頁,共11頁,2023年,2月20日,星期六2.3儀器恒溫水浴鍋、冷凍高速離心機、可見分光光度計、研缽、玻棒、燒杯、量筒,等。第5頁,共11頁,2023年,2月20日,星期六四、操作步驟
4.1SOD粗提液的制備1、組織細胞破碎:稱取5g大蒜蒜瓣或玉米種子,置于研缽中研磨。2、SOD的提取:破碎后的組織中加入2-3倍體積的0.05mol/L磷酸緩沖液(pH7.8),繼續(xù)研磨20min,使SOD充分溶解到緩沖液中,然后在5000rpm下離心15min,取上清液。3、除雜蛋白:上清液加入0.25體積的氯仿-乙醇混合液攪拌15min,5000rpm離心15min,得到的上清液為粗酶液。第6頁,共11頁,2023年,2月20日,星期六4、SOD的沉淀分離:粗酶液中加入等體積的冷丙酮,攪拌15min,5000rpm離心15min,得SOD沉淀。將SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸緩沖液(pH7.8)中,于55-60℃熱處理15min,得到SOD酶液。第7頁,共11頁,2023年,2月20日,星期六3.2SOD活性測定試劑(mL)空白對照管樣品管碳酸緩沖液5.05.0EDTA溶液0.50.5蒸餾水0.5—樣品液—0.5混合均勻,在30℃水浴中預熱5min,測定OD480第8頁,共11頁,2023年,2月20日,星期六3.3結果計算總酶活力=酶液總體積X稀釋倍數(shù)/抑制50%的酶液量X樣品重第9頁,共11頁,2023年,2月20日,星期六五、本實驗教學內容的重點和難點
重點:粗提液的獲得玉米SOD的提取難點:提取條件的控制第10頁,共11頁,2023年,2月20日,星期六六、本實驗教學內的深化和拓展
通過本實驗的學習,使學生明確實驗的意義
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