實(shí)驗(yàn)四福林酚試劑法測(cè)定血清總蛋白

實(shí)驗(yàn)四福林酚試劑法測(cè)定血清總蛋白第1頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

學(xué)習(xí)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定方法學(xué)習(xí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及用標(biāo)準(zhǔn)曲線求待測(cè)物質(zhì)含量的方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六蛋白質(zhì)濃度測(cè)定雙縮脲法微量凱氏定氮法Folin-酚試劑法紫外吸收法實(shí)驗(yàn)原理

第3頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六雙縮脲反應(yīng)：在堿性條件下，雙縮脲可與銅離子結(jié)合生成紫紅色化合物。

雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)H2N-CO-NH2+NH2-CO-NH2H2N-CO-NH-CO-NH2

＋NH3雙縮脲第4頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六具有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應(yīng)，顏色深淺與其濃度成正比，可用比色法進(jìn)行測(cè)定。本法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，干擾物質(zhì)少。但缺點(diǎn)是靈敏度較低測(cè)定蛋白質(zhì)范圍為1-10mg第5頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六微量凱氏定氮法含氮化合物與濃硫酸共熱分解產(chǎn)生氨，氨與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨。硫酸銨在強(qiáng)堿作用下分解生成氨；用水蒸汽蒸餾法將氨蒸入無(wú)機(jī)酸溶液中，然后再用標(biāo)準(zhǔn)酸溶液進(jìn)行滴定，所用無(wú)機(jī)酸的量相當(dāng)于被測(cè)樣品中氨的量，從而可計(jì)算樣品的含氮量。蛋白質(zhì)含氮量通常在16%左右，將測(cè)得的含氮量乘上6.25，便得到該樣品的蛋白質(zhì)含量。第6頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

Folin—酚試劑法(Lowry法)Step1堿性條件下蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)－銅復(fù)合物蛋白質(zhì)－銅復(fù)合物使磷鎢酸—磷鉬酸還原蛋白質(zhì)中含有酚基的酪氨酸，可使酚試劑中的磷鎢酸—

磷鉬酸還原而呈藍(lán)色顯色反應(yīng)(藍(lán)色)。在一定條件下，藍(lán)色強(qiáng)度(A660)與蛋白質(zhì)的量成正比例Step2第7頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六優(yōu)點(diǎn):

缺點(diǎn):操作簡(jiǎn)便靈敏度高有蛋白質(zhì)特異性的影響；受多種因素干擾可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5μg/ml，通常測(cè)定范圍是25-250μg/ml

第8頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六干擾物質(zhì)蔗糖Tris緩沖液硫酸胺酚類(lèi)尿素檸檬酸胍硫酸鈉三氯乙酸乙醇丙酮CHAPSEDTAEGTAHEPESTritonX-100dithiothreitol第9頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)器材與試劑大試管、刻度吸量管、恒溫水浴箱

722E型分光光度計(jì)試劑甲，試劑乙標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（250μg/ml）待測(cè)血清（稀釋500倍）第10頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六空白(1)(2)(3)(4)(5)(6)待測(cè)管（7）標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(250μg/ml)--0.20.40.60.81.0—待測(cè)血清——————1.0蒸餾水1.00.80.60.40.20--試劑甲3.03.03.03.03.03.03.0取7支潔凈試管，按下表加入試劑

實(shí)驗(yàn)步驟第11頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六混勻后室溫放置20分鐘在各試管中分別加入試劑乙0.3mL30分鐘后以空白管為對(duì)照測(cè)其吸光值(660nm)立即搖勻第12頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)管對(duì)照法

計(jì)算及繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線第13頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六朗伯比爾定律：A=εclε：摩爾吸光系數(shù)

c：溶液的濃度

l：液層的厚度

A：物質(zhì)的吸光度

當(dāng)某單色光通過(guò)溶液時(shí)，其能量就會(huì)被吸收而減弱，光能量減弱的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系，也即符合于比色原理---朗伯-比耳定律

第14頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

標(biāo)準(zhǔn)曲線法在分光光度計(jì)測(cè)定范圍內(nèi)，配制一系列已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在特定波長(zhǎng)條件下分別測(cè)出其吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的溶液濃度為橫坐標(biāo)在坐標(biāo)紙上作出一條吸光度與濃度成正比，并且通過(guò)原點(diǎn)的直線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線，也稱C-A曲線第15頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六＊＊＊＊＊CA標(biāo)準(zhǔn)曲線CXAX

CX為根據(jù)待測(cè)樣品的吸光值查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的蛋白質(zhì)濃度0C2C3C4C5C6A2A3A4A5A6第16頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六在圖上查出待測(cè)管的濃度后，按下列公式進(jìn)行計(jì)算：待測(cè)血清蛋白含量=C7×4.31（g/L）×500M7（μg）×5001000或者=第17頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六注意事項(xiàng)

作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線至少要5個(gè)點(diǎn)被測(cè)物與標(biāo)準(zhǔn)物應(yīng)在相同條件下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線中標(biāo)準(zhǔn)物濃度有一定的線性范圍，應(yīng)使標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍在被測(cè)物質(zhì)濃度的1/2～2倍之間，并使吸光度在0.05～1.0范圍為宜第18頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六待測(cè)血清蛋白含量=A待測(cè)A標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)×500V標(biāo)準(zhǔn)V待測(cè)×（g/L）注：V標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)管加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的體積

V待測(cè)為待測(cè)管加入的待測(cè)血清的體積

選一管與待測(cè)管吸光度相近的作為標(biāo)準(zhǔn)管，根據(jù)公式計(jì)算：標(biāo)準(zhǔn)管對(duì)照法第19頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六標(biāo)準(zhǔn)管待測(cè)管實(shí)驗(yàn)結(jié)果第20頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六管號(hào)1234567OD660nm00.1210.2500.3350.4400.5250.320MXAXM7（μg）×5001000C血清=149（μg）=74.5（g/L）第21頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六管號(hào)1234567OD660nm00.1210.2500.3350.4400.5250.320C血清=?人血清中蛋白質(zhì)的正常范圍為60-80g/L0.3200.335×0.250.61A待測(cè)A標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)×500V標(biāo)準(zhǔn)V待測(cè)×=71.6g/L第22頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

標(biāo)準(zhǔn)曲線法比標(biāo)準(zhǔn)管法精確，可消除各種原因引起的偏離吸收定律而造成的誤差，但是制作比較費(fèi)時(shí)。

臨床應(yīng)用：可用于成批樣品的測(cè)定，簡(jiǎn)便省時(shí)第23頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六血清總蛋白含量關(guān)系到血液與組織間水分的分布情況，在機(jī)體脫水的情況下，血清總蛋白質(zhì)含量升高，而在機(jī)體發(fā)生水腫時(shí)，血清蛋白含量下降，所以測(cè)定血清蛋白質(zhì)含量具有臨床意義。

臨床意義：第24頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期六思考題什么叫標(biāo)準(zhǔn)曲線？繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線