實驗八的限制性內(nèi)切酶酶切和鑒定

實驗八的限制性內(nèi)切酶酶切和鑒定第1頁，共11頁，2023年，2月20日，星期六一、實驗?zāi)康恼莆障拗菩詢?nèi)切酶的特性。了解限制性內(nèi)切酶的用途。第2頁，共11頁，2023年，2月20日，星期六二、DNA限制性內(nèi)切酶概述和分析

限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結(jié)合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA分子,然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成:一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列;另一種為獨立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。

絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識別長度為4至8個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列。第3頁，共11頁，2023年，2月20日，星期六GAATTCCTTAAGEcoRⅠ

AAGCTTTTCGAAHindⅢ

5′5′5′5′第4頁，共11頁，2023年，2月20日，星期六第5頁，共11頁，2023年，2月20日，星期六質(zhì)粒pUC18的物理圖譜第6頁，共11頁，2023年，2月20日，星期六三、材料重組質(zhì)粒；EcoRI酶及其酶切緩沖液:購買成品；HindⅢ酶及其酶切緩沖液:購買成品;瓊脂糖(Agarose)。四、儀器移液器及吸頭，水平式電泳裝置,電泳儀,臺式高速離心機,恒溫水浴鍋,微量移液槍,微波爐或電爐,紫外透射儀。

第7頁，共11頁，2023年，2月20日，星期六五、試劑

1、5×TBE電泳緩沖液：配方見第一章。

2、6×電泳載樣緩沖液：0.25％溴粉藍，40％(w/v)蔗糖水溶液，貯存于4℃。

3、溴化乙錠(EB)溶液第8頁，共11頁，2023年，2月20日，星期六六、操作步驟

1、將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf管(最好0.5ml)編號,用微量移液槍分別加入質(zhì)粒DNA（5---14μl）和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10×緩沖液2μl,再加入重蒸水使總體積為18μl,將管內(nèi)溶液混勻后加入EcoRI和HindⅢ各1μl,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整個實驗成敗的關(guān)鍵,要防止錯加，漏加。使用限制性內(nèi)切酶時應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低。

2、混勻反應(yīng)體系后,將eppendorf管置于適當?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?37℃水浴保溫1-3小時,使酶切反應(yīng)完全。

3、每管加入2μl0.1mol/LEDTA(pH8.0),混勻,以停止反應(yīng),置于冰箱中保存?zhèn)溆?。?頁，共11頁，2023年，2月20日，星期六七、電泳檢測在1％瓊脂糖凝膠上進行電泳，EB染色，紫外透射儀下觀察或拍照。第10頁，共11頁，2023年，2月20日，星期六思考題：寫出EcoRI和Hi