神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和外源基因在其中的表達(dá)

神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和外源基因在其中的表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstemcells，NSCs）是一類可自我復(fù)制并分化成神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的多能細(xì)胞，其在治療神經(jīng)退行性疾病、脊髓和大腦損傷等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。體外培養(yǎng)是研究和應(yīng)用NSCs最常用的手段，通過合適的培養(yǎng)條件，可以促進(jìn)NSCs增殖和分化，并從中獲得大量的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和OLPs（oligodendrocyteprogenitorcells）。此外，外源基因在NSCs中的表達(dá)也是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，通過引入特定的基因序列，可以實(shí)現(xiàn)NSCs的定向分化、細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)化以及復(fù)雜神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建立等功能。

一、神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法

1.來源及分離

NSCs在胚胎發(fā)育和成年人中均存在，來源包括胚胎干細(xì)胞、胚胎腦、成人大腦和它們的亞型等。如何高效、純化地獲取NSCs是體外培養(yǎng)的第一步。常用的NSCs來源及處理方法如下：

（1）胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcells，ESCs）：體外誘導(dǎo)ESC分化為NSCs的方法較為成熟，但ESC的來源受到道德和法規(guī)的限制，應(yīng)用范圍相對(duì)小。

（2）胚胎腦：通過胚胎腦的懸浮培養(yǎng)、機(jī)械和化學(xué)分離等方法，可以將NSCs從中分離出來。

（3）成人大腦：近年來的研究表明，成人大腦中也存在NSCs，可以通過基因表達(dá)譜分析或熒光標(biāo)記的細(xì)胞顆粒來篩選NSCs，并在體外培養(yǎng)中進(jìn)行進(jìn)一步的繁殖和分化。

2.培養(yǎng)基的配方

NSCs的培養(yǎng)需要一種復(fù)雜的培養(yǎng)基，其中至少應(yīng)包括以下組分：營(yíng)養(yǎng)成分、生長(zhǎng)因子、抗生素、酶解液和緩沖液等。常見的培養(yǎng)基及其組分如下：

（1）N2B27：可能是最常用的NSCs培養(yǎng)基，包括DMEM/Ham’sF12、N2和B27等組分。其中N2是一種無血清添加劑，是神經(jīng)細(xì)胞特異性營(yíng)養(yǎng)成分的混合液，可以提高神經(jīng)小管的生長(zhǎng)和穩(wěn)定神經(jīng)元表型。B27包括28種胱抑素、抗氧化劑和其他生長(zhǎng)因子，已經(jīng)被證明在維持NSCs的自我更新和神經(jīng)分化中起重要作用。

（2）Neurobasal：由具有抗氧化活性和脈沖響應(yīng)因子的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞衍生的培養(yǎng)基。

（3）DMEM/F12：經(jīng)常加入N2和B27，以支持NSCs的減少分化和生長(zhǎng)。

3.分化誘導(dǎo)

NSCs存活時(shí)細(xì)胞內(nèi)有完整的表觀遺傳調(diào)控系統(tǒng)，其表達(dá)譜受于復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過培養(yǎng)基的組分和特定的生長(zhǎng)因子，可以向著特定的神經(jīng)細(xì)胞類型誘導(dǎo)NSCs分化，包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和熟化的OLPs等。

二、外源基因在神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)

外源基因在NSCs中的表達(dá)可以通過轉(zhuǎn)染病毒、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、高效轉(zhuǎn)染物質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染等方法來實(shí)現(xiàn)。目前，最常用的轉(zhuǎn)染載體是病毒，包括質(zhì)粒病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒等。這些病毒將外源DNA序列嵌入NSCs的染色體DNA，從而實(shí)現(xiàn)在NSCs中的恒定表達(dá)。

外源基因在NSCs中的表達(dá)可應(yīng)用于下列研究領(lǐng)域：

1.定向分化

NSCs的分化方向是其未來的細(xì)胞命運(yùn)。NSCs的未分化狀態(tài)支持著其自我信號(hào)，從而保持其多能性并促進(jìn)其增殖。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入分化狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞開始表達(dá)一些特定的神經(jīng)細(xì)胞類型和功能上的基因，并且停止增殖。外源基因的加入可以改變標(biāo)準(zhǔn)分化協(xié)議中的基因表達(dá)譜，以間接地操縱NSCs的命運(yùn)。例如，人工過表達(dá)ATOH1基因可以在體外誘導(dǎo)成人NSCs分化成某種神經(jīng)元類型。

2.細(xì)胞修復(fù)

NSCs在體內(nèi)可以游走到受損區(qū)域并成為解決方案的一部分。在體外，NSCs也可以被應(yīng)用于維修或取代受損的神經(jīng)組織。對(duì)這種應(yīng)用的限制在于，NSCs很難定向分化成特定類型的細(xì)胞，并且在體內(nèi)NSCs的壽命比較短。引入外源基因可能會(huì)在分化NSCs的方向上起作用。在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面，NSCs和外源基因的聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)出了良好的治療效果。例如，在肌萎縮側(cè)索硬化癥治療中，NSCs擔(dān)任了產(chǎn)生可維持神經(jīng)髓鞘的細(xì)胞類型的角色。

3.細(xì)胞命運(yùn)重編程

細(xì)胞重編程是將已分化細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槿軤顟B(tài)的一種過程。這可以通過一些特定外源因素來完成，例如低分子化合物、mRNA、微RNA和外源基因等。外源基因可以促進(jìn)NSCs的全能狀態(tài)，并可以轉(zhuǎn)化成多種類型的神經(jīng)細(xì)胞。例如，人工過表達(dá)Pax6基因可以在體外將NSCs轉(zhuǎn)化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄因子NeuroD1可以將NSCs轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。

三、結(jié)論

總之，NSCs在體外的培養(yǎng)和外源基因的引入是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的前沿研究。在完善培養(yǎng)系統(tǒng)和了解細(xì)胞特異性之后，NSCs有望在解決神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面發(fā)揮更廣泛的作用。同時(shí)，NSCs的繁殖和分化過程可以使神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的過程被重新建造，以期獲得更深入的理解。外源基因的應(yīng)用也是研究神經(jīng)科學(xué)中的一個(gè)難題，但這個(gè)難題前景十分光明，未來可以為應(yīng)用、基礎(chǔ)科學(xué)和神經(jīng)學(xué)提供無限可能。四、神經(jīng)干細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的應(yīng)用

由于神經(jīng)干細(xì)胞具有多能性、自我復(fù)制和分化能力，可以分化為多種神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，因此，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方面，神經(jīng)干細(xì)胞具有廣泛的應(yīng)用前景。神經(jīng)干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用主要包括以下方面：

1.腦損傷恢復(fù)

神經(jīng)干細(xì)胞可以分化為不同類型的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，因此在腦損傷、中風(fēng)和腦外傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中具有廣泛的應(yīng)用。神經(jīng)干細(xì)胞移植后可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和組織修復(fù)，并調(diào)節(jié)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的功能，從而改善神經(jīng)系統(tǒng)疾病的癥狀。

2.神經(jīng)退行性疾病治療

神經(jīng)退行性疾病是由神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元或神經(jīng)元的突出部分遭受損害而引起的疾病，如阿爾茨海默病、亨廷頓病和帕金森病等。神經(jīng)干細(xì)胞在治療神經(jīng)退行性疾病方面具有廣泛的應(yīng)用前景，能夠分化成多種神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，并在神經(jīng)退行性疾病患者中恢復(fù)受損的神經(jīng)系統(tǒng)功能。

3.脊髓損傷治療

脊髓是人體神經(jīng)系統(tǒng)的主要傳導(dǎo)通路，如果脊髓受到損傷，就會(huì)影響神經(jīng)信號(hào)的傳遞，導(dǎo)致不同程度的功能障礙。通過移植神經(jīng)干細(xì)胞，可以促進(jìn)脊髓的修復(fù)和再生，并最終使患者恢復(fù)損傷前的功能。

4.白質(zhì)病變治療

白質(zhì)是神經(jīng)系統(tǒng)中的主要結(jié)構(gòu)組成部分之一，由多神經(jīng)突出部分（軸突）及其周圍的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成。與白質(zhì)相關(guān)的疾病包括多發(fā)性硬化癥（MS）等，該疾病導(dǎo)致神經(jīng)髓鞘遭受損害，導(dǎo)致軸突失去保護(hù)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死