蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)

蛋白質(zhì)純化試驗(yàn)試驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介：雙向電泳（two-dimensionalelectrophoresis）是等電聚焦電泳和SDS的組合，即先進(jìn)行等電聚焦電泳（依據(jù)pl分別）,然后再進(jìn)行SDS（依據(jù)分子大?。?jīng)染色得到的電泳圖是個(gè)二維分布的蛋白質(zhì)圖?！揪R生物】試驗(yàn)操作流程：1、樣本制備2、固相預(yù)制膠條水化3、第一向等電聚焦（IEF）4、膠條平衡5、其次向SDS電泳6、凝膠染色檢測(cè)7、圖片掃描試驗(yàn)留意事項(xiàng)：客戶供應(yīng)：1、原樣(組織、細(xì)胞、菌體等)濕重不少于200mgo2、蛋白提取物，濃度不少于4ug/ul,總量不少于5mgo3、寄樣須知：樣品需低溫保存，用干冰保存快遞。交付標(biāo)準(zhǔn)：1、雙向電泳電子圖片及定量分析結(jié)果，包括差異點(diǎn)號(hào)碼、差異倍數(shù)。2、差異點(diǎn)的一級(jí)質(zhì)譜或二級(jí)質(zhì)譜峰圖，質(zhì)譜鑒定結(jié)果，包括pl和MW等。3、雙向電泳完整的試驗(yàn)步驟、使用儀器、軟件檢索參數(shù)等。一、儀器設(shè)施色析管柱(PharmaciaCcolumn,1.6x100cm)、鐵架、鐵夾及水平儀;部分收集器(fractioncollector,需預(yù)備潔凈試管約100支);濃縮用離心機(jī)(低速5,000rpm);濃縮用離心管Centriprep-30(Amicon4322)請(qǐng)留意其使用方法。二、藥品試劑膠體SephacrylS-300(Pharmacia):a.預(yù)先以緩沖液bufferA-150平衡好,并且使完全沈降后的膠體體積，占全部體積的七至八成；要先預(yù)估好膠體的使用量。b.膠體溫度要與操作場(chǎng)所的溫度全都，否則溫度變化會(huì)產(chǎn)生氣泡。c.Sephacryl系列膠體有相當(dāng)大的吸附力，因此要在緩沖液加入0.15M以上的NaCI以除去非專一性吸附。BufferA-150:留意使用時(shí)的溫度要與管柱膠體的溫度全都標(biāo)準(zhǔn)分子量組合(Bio-Rad151-1901):溶于1mL后每組取0.4mL.含有thyroglobulin(670kD),bovinegammaglobulin(158kD),chickenovalbumin(44kD),equinemyoglobin(17kD),vitaminB12(1350)三、管柱裝填.以純水沖洗玻璃管柱(以純水上下沖洗即可，嚴(yán)禁使用試管刷)；并請(qǐng)了解管柱的構(gòu)造與拆裝方法，垂直架好管柱，以軟管連接部分收集器，并以bufferA-150試看管路是否通暢；可以用止血鉗或長(zhǎng)尾文書夾夾住出口軟管，則可掌握溶離的進(jìn)行。留意系統(tǒng)的擺設(shè)要適當(dāng)，不要裝置于交通要沖。.依預(yù)估量取出Sephacryl膠體，留意膠體的溫度與緩沖液是否已平衡;將瓶中的膠體上下震蕩，使的完全懸浮，但勿產(chǎn)生太多氣泡。.在管柱內(nèi)加入約10cm高緩沖液，然后將膠體漸漸沿著管壁倒入管柱，始終加到管柱頂端，開頭流洗后膠體沈降很快。當(dāng)膠體上方的液面漸漸降低時(shí)，可于頂端添加膠體，以達(dá)所要高度；膠體高度約90cmo.膠體完全沈降后，當(dāng)心以bufferA-150加滿管柱，關(guān)閉出口，裝上頂端端蓋并連通緩沖液瓶，打開出口以重力流洗。調(diào)整緩沖液瓶高度，使流速約每五?六秒一滴，并設(shè)定收集體積為2.5mL/tube0.膠柱流洗約100mL后，關(guān)閉出口，拆開頂端端蓋，先以滴管吸出膠體上方的溶液到剩約1cm高，留意勿破壞膠體表面平整；然后打開出口，使液面下降至膠風(fēng)光，再關(guān)閉出口，預(yù)備注入樣本。四、樣本色析進(jìn)行.以微量移液器或滴管吸取樣本（樣本體積不得超過膠體總體積的3%）,沿著膠體上方管壁緩慢加入，留意切勿破壞膠體的平整表面?。颖镜拇_體積mL）.打開出口，同時(shí)開啟部分收集器；當(dāng)樣本完全沒入膠體時(shí)，關(guān)閉出口，緩緩加入與樣本相等體積的bufferA-150,打開出口待其漸漸進(jìn)入膠體中，如此重復(fù)二次。不得擾動(dòng)膠體表面，造成凹陷。.臨時(shí)關(guān)閉出口，將液面高度加滿至管柱頂端，并把頂端端蓋鎖上；然后打開出口開頭溶離，調(diào)整緩沖液瓶的高度，使流速為6s一滴。.要留心觀看前面幾個(gè)分劃，確定整個(gè)系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)無礙，當(dāng)心部分收集器最簡(jiǎn)潔出問題。管柱估計(jì)將流洗過夜，收集約80管。收集試管，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析以及GUS活性測(cè)定，并請(qǐng)作圖。5.收集GUS活性區(qū)，以Centriprep-30濃縮至10mL后，加bufferA-0稀釋至20mL,再次濃縮至mL（GF），保留100pLo6.管柱請(qǐng)?jiān)僖詁ufferA-150流洗100mL后，當(dāng)心放置一旁，預(yù)備以后進(jìn)行分子量測(cè)定。五、分子量測(cè)定.進(jìn)行分子量測(cè)定前一天,請(qǐng)先以bufferA-150流洗100mL,并檢查膠柱內(nèi)有無氣泡產(chǎn)生，若有嚴(yán)峻的氣泡或干裂，必需重新裝填管柱。.取標(biāo)準(zhǔn)分子量溶液0.4mL,加上純質(zhì)目標(biāo)酶0.5mL(以親和層析法所得的AF部份)，如上法注入管柱中，立即開頭進(jìn)行膠體過濾，并收集各分劃。請(qǐng)依循上述全部管柱及分劃收集器的操作要點(diǎn)。.收集所得，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析，可定出數(shù)個(gè)蛋白質(zhì)尖峰，以作為分子量依據(jù)；另以目測(cè)法，打算紅色高峰的管數(shù)，則可定出vitaminB12的溶離管數(shù)。采用以上數(shù)據(jù),可畫出分子量與溶離管數(shù)間的直線關(guān)系，作為分子量判定的標(biāo)準(zhǔn)校正線。.同樣的一批分劃，請(qǐng)進(jìn)行酶活性分析(GUS),則可定出酶的溶離體積，對(duì)比上述標(biāo)準(zhǔn)校正線，則可求出酶的分子量。六、拆除管柱及保存膠體.若管柱長(zhǎng)期不用，應(yīng)自管柱中取出膠體，以緩沖液清洗后，置冷藏室中保存，但肯定不要放在冷凍箱中。膠體若裝填太緊，有時(shí)可能不易取出，要有急躁地以緩沖液漸漸沖出來。.膠體可以加0.01%NaN3防止霉菌生長(zhǎng)，但使用前記得要洗去；再度使用時(shí)，請(qǐng)檢查膠體中有無灰黑色霉菌顆粒，若有結(jié)塊而不易打散者，也不要使用。蛋白質(zhì)的分別純化方法(1)依據(jù)分子大小不同進(jìn)行分別純化。蛋白質(zhì)是一種大分子物質(zhì)，并且不同蛋白質(zhì)的分子大小不同，因此可以采用一些較簡(jiǎn)潔的方法使蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)分開，并使蛋白質(zhì)混合物也得到分別。依據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進(jìn)行分別的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。(2)依據(jù)溶解度不同進(jìn)行分別純化。影響蛋白質(zhì)溶解度的外部條件有很多，比如溶液的pH值、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度等。但在同一條件下，不同的蛋白質(zhì)因其分子結(jié)構(gòu)的不同而有不同的溶解度，依據(jù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，適當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)變外部條件，就可以選擇性地掌握蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度，達(dá)到分別純化蛋白質(zhì)的目的。常用的方法有等電點(diǎn)沉淀和pH值調(diào)整、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析、有機(jī)溶劑法、雙水相萃取法、反膠團(tuán)萃取法等。(3)依據(jù)電荷不同進(jìn)行分別純化。依據(jù)蛋白質(zhì)的電荷即酸堿性質(zhì)不同分別蛋白質(zhì)的方法有電泳和離子交換層析兩類。電泳是在外電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒(如不處于等電點(diǎn)狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子)將向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。聚丙烯酰胺電泳是一種以聚丙烯酰胺為介質(zhì)的區(qū)帶電泳，常用于分別蛋白質(zhì)。離子交換層析是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流淌相中的組分別子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分別的一種層析方法。(4)采用對(duì)配體的特異親和力進(jìn)行分別純化。親和層析是采用蛋白質(zhì)分子對(duì)其配體分子特有的識(shí)別力量建立起來的一種有效的純化方法。近年來，親和層析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于融合蛋白的分別純化上，由于融合蛋白具有特異性結(jié)合力量。但是在實(shí)際工作中，很難用單一方法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分別純化，往往要綜合幾種方法才能提純出一種蛋白質(zhì)。抱負(fù)的蛋白質(zhì)分別提純方法，要求產(chǎn)品純度和總回收率越高越好，但實(shí)際上兩者難以兼顧。隨著生物分別技術(shù)