大氣壓等離子體射流對黑素瘤作用的研究,皮膚病學(xué)論文

大氣壓等離子體射流對黑素瘤作用的研究,皮膚病學(xué)論文黑素瘤作為一種起源于皮膚、粘膜、眼和中樞神經(jīng)系統(tǒng)色素沉積區(qū)域的黑色素細胞的高度惡性腫瘤，是一種由異常黑色素細胞過度增生引發(fā)的常見皮膚惡性腫瘤，是皮膚癌的前期異常感覺和狀態(tài)[1-3].在所有的皮膚惡性腫瘤中黑素瘤的發(fā)病率居第三位，占皮膚腫瘤死亡病例的極大部分，近年來國內(nèi)外發(fā)病率呈不斷上升趨勢。當(dāng)前治療黑素瘤的主要方式方法是是外科手術(shù)切除和放化療，然而手術(shù)創(chuàng)傷大，局部廣泛切除后還需再進行植皮手術(shù)，放化療則副反響大，在殺滅腫瘤細胞的同時也殺滅了正常細胞。近年來，低溫等離子體〔LowTemperaturePlasma,LTP〕在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，主要集中在廢液廢氣、醫(yī)療器械、食品等的消毒滅菌和改善醫(yī)用生物材料的生物相容性等方面，已獲得了顯著的成效，被國內(nèi)外大量研究所證實[4].同時，LTP也逐步開場應(yīng)用于對人和動物活細胞的處理，人們嘗試著使用LTP來取代或者輔助傳統(tǒng)的醫(yī)療手段和醫(yī)療器械，已初步獲得了一些令人滿意的成果[5].但傳統(tǒng)的LTP源因產(chǎn)生的等離子體位于兩個電極之間或放電效率和活性粒子濃度較低，無法作用于實際人或動物身上的活體細胞或處理效率特別低。因而研究者們利用氣流和電場的共同作用開發(fā)了一種新穎的LTP產(chǎn)生方式方法，即大氣壓等離子體射流〔AtmosphericPressurePlasmaJet,APPJ〕，將放電區(qū)域所產(chǎn)生的等離子體從射流管口噴出。相比于傳統(tǒng)的LTP產(chǎn)生方式方法，APPJ具有無需密封系統(tǒng)、放電區(qū)域與工作區(qū)域分離、活性粒子可隨氣流而作用于對象外表、便于調(diào)控和處理三維復(fù)雜曲面構(gòu)造的對象等優(yōu)點，已逐步被人們應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、材料外表改性、外表刻蝕、薄膜制備等領(lǐng)域，表現(xiàn)出獨特的技術(shù)優(yōu)勢和良好的應(yīng)用前景[6-8].由于APPJ可精到準確定位于腫瘤組織，進而避免對正常細胞和組織的毀壞，具有創(chuàng)傷小和副反響小的優(yōu)點。因而如可采用APPJ等手段，來代替手術(shù)切除、化療等常用醫(yī)療手段或醫(yī)療器械，不僅能夠減輕藥物所帶來的副作用和化療手段所帶來的宏大疼痛，還能夠到達經(jīng)濟有效治療的目的。本實驗首先通過兩種APPJ裝置，將小鼠體外黑素瘤作為APPJ作用的研究對象，通過對等離子體參數(shù)與成分的診斷和作用前后黑素瘤細胞相關(guān)參數(shù)〔存活數(shù)、細胞周期分布、凋亡率和黑素含量合成等〕的檢測，來考察和探尋求索APPJ對黑素瘤細胞生長的抑制作用及相關(guān)機制。有望為APPJ治療皮膚惡性腫瘤提供理論基礎(chǔ)，并期望提出治療惡性腫瘤可能的新方式方法，進而減少疾病的折磨，造福于社會。1大氣壓等離子體射流對黑素瘤作用的研究1.1實驗方式方法實驗中選用小鼠黑素瘤細胞〔B16〕進行體外培養(yǎng)，所使用培養(yǎng)液為RPMI-1640細胞培養(yǎng)液〔含10%小牛血清，100U/mL青霉素與0.1mg/L鏈霉素〕，置于37℃，5%CO2孵育箱孵育，每三天更換一次培養(yǎng)液，次，待成纖維細胞長滿瓶壁，用0.25%胰蛋白酶消化，并用PBS將細胞濃度調(diào)至1106/mL.培養(yǎng)完畢后將細胞從培養(yǎng)瓶壁上消化下，離心后參加培養(yǎng)液進行吹打，隨后將含有細胞的培養(yǎng)液參加醫(yī)用96孔板，因96孔板的孔徑與石英管APPJ的大小差不多，因而我們選用了石英管ArAPPJ置于96孔板上方來處理小鼠黑素瘤細胞。實驗在常氣壓下的超凈工作臺中進行。試驗環(huán)境條件為：室溫20℃，相對濕度60%.實驗數(shù)據(jù)以SD〔均數(shù)標準差〕形式表示，均數(shù)間的差異采用隨機區(qū)組方差分析方式方法檢驗，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。1.2實驗結(jié)果與分析1.2.1細胞存活能力、酪氨酸酶活性及黑色素含量的檢測采用四唑鹽比色實驗來檢測細胞的存活能力，所用的顯色劑為噻唑藍，簡稱為MTT.在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶構(gòu)成的量與細胞數(shù)成正比，用以檢測等離子體能否對癌細胞總量有減少或抑制作用。黑色素合成能力的檢測采用酪氨酸酶活性實驗。黑色素含量則用于判定APPJ處理能否減少了黑素瘤細胞的合成黑色素量。以上三種方式方法在不同APPJ處理時間下的檢測結(jié)果均通過分光度來表示，如此圖4所示?？梢姡陨先N檢測實驗的OD值均隨著APPJ處理時間的增長而逐步減小，意味著細胞存活能力、黑色素合成能力及黑色素含量快速下降，黑素瘤細胞的生長和活性得到了一定程度的抑制。當(dāng)APPJ處理時間4s以上，相比于控制組，三種檢測實驗的OD值開場劇烈下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔P0.05〕?！?】1.2.2電子透射電鏡的觀察利用電子透射電鏡〔TEM〕觀察APPJ處理前后黑素瘤細胞的形貌變化情況。詳細步驟如下：將經(jīng)APPJ處理后的懸濁液，在3000g下離心10min,棄去上清液；沉淀由PBS清洗3次，每次3000g,5min;參加2mL戊二醇〔2.5%〕在4C下固定24h,之后用0.1M的PBS浸洗30min;參加2.5%的四氧化鋨在4C下固定2h后，用0.1M的PBS浸洗10min,乙醇梯度脫水；環(huán)氧樹脂Epon812浸透、包埋，聚合后利用超薄切片機〔瑞典LKB-V〕進行超薄切片50~70nm,作超薄切片；醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，透射式電子顯微鏡〔日本日立H-600〕下觀察、拍照。如此圖2所示?？梢姡蟛糠旨毎募毎诤图毎て屏?，細胞內(nèi)物質(zhì)逸出；并且比照圖5〔b〕和圖5〔d〕的細胞器圖可見，經(jīng)APPJ處理之后，細胞的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大大減少，整個細胞器變得空曠。1.2.3細胞凋亡率檢測細胞凋亡是指細胞在特定的內(nèi)源和外源信號誘導(dǎo)下，其死亡途徑被激活，并在有關(guān)基因的調(diào)控下發(fā)生的程序性死亡經(jīng)過。凋亡細胞數(shù)目越多，則講明等離子體處理對癌細胞生長有抑制作用，促進其細胞凋亡，有助于減緩癌細胞瘋長，減輕患者異常感覺和狀態(tài)。通過將細胞懸液離心、參加緩沖液后置于488nm氬離子激光器檢測，檢測結(jié)果如表1.可見，當(dāng)APPJ處理時間高于4s之后，黑素瘤細胞中凋亡細胞的百分比快速增大，6s之后壞死細胞的百分比也快速增大，這講明APPJ只需處理6s以上就可殺滅絕大部分的黑素瘤細胞?！?】1.3APPJ作用黑素瘤細胞的機理討論從實驗結(jié)果和分析中可知，APPJ可快速〔幾s內(nèi)〕殺死黑素瘤細胞，毀壞細胞壁和膜，抑制黑素瘤細胞的生長，這表示清楚這是APPJ中的某種物質(zhì)能夠毀壞細胞壁和細胞膜，使得細胞壁和細胞膜破裂，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大大減少，并使得細胞質(zhì)從細胞中泄漏出來，抑制黑素瘤細胞的活性、合成能力與生長，使細胞趨于凋亡和壞死。因ArAPPJ為低溫等離子體，通過紅外測溫可知其溫度約在室溫范圍，因而溫度效應(yīng)能夠基本忽略。由圖3可知，ArAPPJ中包含的作用于生物細胞的活性成分包括紫外線、帶電粒子〔電子、陰陽離子如N2+〕以及活性氧和活性氮種〔reactiveoxygenandnitrogenspecies,RONS,比方OH自由基、原子態(tài)氧、激發(fā)的N2和O3〕。由于在大氣壓下的APPJ中，紫外線可被等離子體和周圍空氣吸收，不能到達被處理的樣品外表，所以紫外線的作用在APPJ對生物細胞的處理經(jīng)過中可以以忽略。因而，國內(nèi)外多數(shù)研究者以為RONS在大氣壓LTP對生物細胞的處理經(jīng)過中發(fā)揮主要作用[9,10].在APPJ中，RONS能夠到達被處理的細胞樣品外表，因而我們同樣基本以為RONS對黑素瘤細胞作用效果最大。在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)、蛋白泛素化及降解、細胞骨架以及細胞周期調(diào)控蛋白等系統(tǒng)都介入RONS的細胞周期調(diào)控作用。RONS的增加激活了p21Cip1的表示出并導(dǎo)致細胞周期G1期阻滯，這種G1期細胞周期阻滯最終導(dǎo)致了細胞凋亡。2結(jié)論利用所開發(fā)的兩種ArAPPJ裝置，結(jié)合等離子體參數(shù)與成分的診斷，以及作用前后黑素瘤細胞相關(guān)參數(shù)〔存活數(shù)、細胞周期分布、凋亡率和黑素含量合成等〕的檢測，研究了APPJ對小鼠黑素瘤細胞〔B16〕的抑制作用及相關(guān)機制。得到了如下結(jié)論：兩種ArAPPJ應(yīng)用安全可靠，且富含OH自由基；APPJ處理可毀壞黑素瘤細胞壁和細胞膜，大大減少細胞的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，抑制黑素瘤細胞的生長和活性，使細胞趨于凋亡和壞死，討論以為APPJ中的RONS發(fā)揮了主要的抑制作用；以下為參考文獻[1]廖懷偉,劉麗忠,文輝才.皮膚黑色素瘤的治療新進展[J].中華實驗外科雜志,28〔11〕：2020-2021,2018.[2]韓睿,程浩,朱可建.惡性黑素瘤38例臨床分析[J].中國皮膚性病學(xué)雜志,28〔7〕：477-478,2007.[3]朱健偉,駱丹.黑素瘤細胞粘附與遷移相關(guān)外表分子研究進展[J].腫瘤基礎(chǔ)與臨床,19〔6〕：531-534,2006.[4]Kedzierski