微透析應用和進展專家講座

微透析技術應用進展中醫(yī)藥學院中藥新藥試驗室微透析應用和進展第1頁微透析技術基本原理微透析技術發(fā)展沿革及優(yōu)缺點微透析系統(tǒng)組成微透析探針設計及種類微透析技術定量研究微透析技術在生物學中應用

主要內(nèi)容微透析應用和進展第2頁

微透析技術（microdialysis，簡稱MD）是從神經(jīng)化學領域發(fā)展起來能夠對內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物進行實時取樣新技術。微透析應用和進展第3頁微透析技術基本原理透析針插入生物組織或生物母體,灌流液由體外微量灌流泵推入膜內(nèi)套管,透析膜孔徑允許小分子自由擴散經(jīng)過而阻止蛋白質(zhì)等大分子經(jīng)過，透過膜小分子物質(zhì)被透析管內(nèi)連續(xù)流動灌流液不停帶出。微透析應用和進展第4頁活體微透析技術原理示意圖微透析應用和進展第5頁微透析應用和進展第6頁微透析應用和進展第7頁微透析技術發(fā)展沿革由早期神經(jīng)化學試驗室中灌流取樣技術發(fā)展和延伸而來。1961年Gaddum推拉式灌流取樣技術1972年Delgado組織透析取樣技術1974年Ungestedt深入發(fā)展，申請適合用于人和動物專利微透析應用和進展第8頁微透析技術發(fā)展沿革早期研究多用于大腦神經(jīng)生物學研究擴展到許多領域：血液、心、肝、腎臟、皮下脂肪組織、眼部組織、肌肉應用到臨床微透析應用和進展第9頁漢字全文期刊網(wǎng)：年45篇，年37篇微透析應用和進展第10頁活體(Invivo)、實時（Intime）、在線（Online）時間分辨性空間分辨性提供游離態(tài)小分子化合物,對藥品研究有主要意義樣品因不含蛋白質(zhì)、酶等大分子物質(zhì)，可不經(jīng)預處理直接用于測定微透析技術(MD)優(yōu)缺點微透析應用和進展第11頁不足：回收率低,通常在15%左右探針植入會造成局部輕微損傷。回收率測定即使種類繁多,但每種方法都不夠完善,影響了實際濃度計算要求探頭必須準確插在同一取樣部位極難進行以秒為單位動態(tài)觀察微透析技術(MD)優(yōu)缺點微透析應用和進展第12頁微量灌流泵探針灌流液搜集器分離檢測裝置微透析系統(tǒng)組成微透析應用和進展第13頁A—灌注液(在透析針內(nèi));B—灌流泵;C—連接管;D—樣品搜集;E—微透析探針微透析系統(tǒng)組成微透析應用和進展第14頁微透析探針關鍵部分是微透析探針：

探針長度普通在0.5-10mm，膜材料慣用纖維素膜、聚丙烯腈膜等組成。

管狀半透膜（微透析膜）進液管出液管針柄部分微透析應用和進展第15頁微透析探針種類微透析探針

分流式（血液和膽汁）依據(jù)材料不一樣并聯(lián)串聯(lián)同心圓式套管式線性環(huán)形柔性（靜脈物質(zhì)）剛性（腦內(nèi)）（皮膚、肌肉、腫瘤）微透析應用和進展第16頁微透析探針種類線性同心圓式柔性分流式微透析應用和進展第17頁串聯(lián)（水平）式探頭主要利用“橫穿腦”技術植入腦或組織內(nèi)。透析管除了透析部分外，表面用一個不通透如環(huán)氧樹脂封閉。此法優(yōu)點在于簡便易行，探頭一旦植入即可隨動物移動。其缺點在于植入過程中要在出入口各打一洞，引發(fā)所經(jīng)過腦區(qū)，顱骨及肌肉產(chǎn)生過多損傷。微透析應用和進展第18頁并聯(lián)（垂直）式探頭經(jīng)過立體定向儀能準確定位到所需測定區(qū)域。同心圓式探頭當前最流行，這種探頭采取管內(nèi)套管設計，能夠制作直徑小，適合于經(jīng)過預先埋置引導管插入組織，為慢性試驗提供方便。微透析應用和進展第19頁灌流液進行微透析試驗時，使用灌流液中各離子組份濃度應與腦內(nèi)（組織）細胞外液保持一致。以腦微透析為例：Ca2+濃度對試驗結果成敗極為關鍵，當前認為細胞外Ca2+濃度預計值1.2mM。試驗室慣用灌流液濃度為，NaCL140mM、KCl2.4mM、MgCL21.0mM、CaCL21.2mM、NaHCO35.0mM、Ascorbicacid0.6mM（pH7.4）。微透析應用和進展第20頁樣品搜集微透析試驗使用灌流速度普通不超出5－10μl/min。高流速并不能深入增加物質(zhì)跨膜流量（絕對回收率），而且灌流液在壓力下流出探頭可能會引發(fā)組織損傷。灌流開始時，回收率較高，普通認為，這是探頭插入所引發(fā)傷害性組織反應。普通經(jīng)過30－60min后，回收率基本趨于穩(wěn)定。微透析應用和進展第21頁樣品檢測透析樣品可直接用HPLC/電化學/熒光/紫外/質(zhì)譜等檢測技術或其它高靈敏度微量化學分析法測定。對于一些含量極低物質(zhì)，可增加回收率方法來填補靈敏度不足。如可加長透析膜有效長度、改變灌流速度，也可使用藥品方法（如在灌流液中添加攝取阻斷劑）以提升待測物質(zhì)含量。微透析應用和進展第22頁樣品檢測依據(jù)分離檢測伎倆不一樣，微透析試驗又能夠分為基于非分離和基于分離微透析方法。微透析應用和進展第23頁基于非分離微透析方法(non一separationbasedapproaches)基于非分離方法主要有生物傳感器法、免疫法和質(zhì)譜法。

生物傳感器主要部分是酶電極，能夠特異地與透析液中待測物反應，并被檢測器檢測。微透析應用和進展第24頁基于分離微透析方法(separationbasedapproaches)：主要有高效液相色譜法(HPLC)和毛細管電泳法(CE)。微透析樣品屬于親水性物質(zhì)離子性溶液

與非分離微透析方法相比，基于分離微透析方法普通能夠同時測定多個化合物。普通來說，依據(jù)檢測物質(zhì)不一樣，紫外、熒光、電化學檢測和質(zhì)譜法是HPLC慣用檢測方法。而CE慣用電化學檢測器和激光誘導熒光法檢測。微透析應用和進展第25頁微透析取樣和多級質(zhì)譜裝置流程圖微透析應用和進展第26頁在線微透析液相色譜電噴霧質(zhì)譜偶聯(lián)裝置示意圖微透析應用和進展第27頁毛細管電泳-多級質(zhì)譜與微透析采樣聯(lián)用示意圖微透析應用和進展第28頁等電電點聚焦-微透析-質(zhì)譜聯(lián)用微透析應用和進展第29頁高效液相離子色譜在線微透析質(zhì)譜聯(lián)用示意圖微透析應用和進展第30頁微透析回收率：探針回收率是指灌流液中流出待測組分與標準濃度之比(Ces/Cos)百分數(shù)。

微透析技術用于定量分析首先應該處理問題就是怎樣對取出樣品進行準確可靠校正。而探針回收率是計算待測物濃度前提條件。微透析技術定量研究微透析應用和進展第31頁探針回收率是影響微透析結果正確性主要原因,其值取決于：取樣部位生物特征透析膜物理及化學性質(zhì)(材料、孔徑、長度及幾何形狀等)待測物分子質(zhì)量在生物介質(zhì)中擴散速度和灌流速度、壓力、溫度等。微透析應用和進展第32頁微透析回收率測定方法：

1體外校正(體外回收率)

當不需測定樣品絕對含量,只需計算被測藥品相對濃度改變時,可采取體外回收率測定方法。測定宜在取樣前后馬上進行,將探針放入已知濃度標準溶液中,用與體內(nèi)試驗相同流速灌流探針,到達穩(wěn)定狀態(tài)后搜集灌流液并進行測定。測定濃度與標準溶液濃度之比就是體外回收率。試驗前后回收率誤差小于5%微透析應用和進展第33頁2體內(nèi)校正需測定樣品絕對含量

內(nèi)標法

零凈流量法

低灌注流速法微透析應用和進展第34頁內(nèi)標法:

將已知濃度內(nèi)標加至灌流液中，假設透析液中待測物與內(nèi)標回收率一致，經(jīng)過內(nèi)標法定量求得待測物絕對量。灌流液中內(nèi)標物已知濃度(Cic)，透析液中內(nèi)標物濃度(Cec)，體內(nèi)回收率(Rin，viv)可用下式計算:Rin，viv=(1-Cec/Cic)×100%微透析應用和進展第35頁①內(nèi)標必須與待測物化學結構相近②二者在血液及組織中擴散及消除速度一致③內(nèi)標不影響所研究藥品在組織中藥理活性微透析應用和進展第36頁零凈流量法:

當透析液中被分析物濃度與體內(nèi)濃度一致時，沒有物質(zhì)交換，到達穩(wěn)態(tài),在該狀態(tài)下，可將一系列已知濃度待測物加至灌流液中以測定透析液中待測物濃度。以透析液中待測物濃度為縱坐標，已知濃度待測物濃度為橫坐標，作直線，其斜率即為回收率。微透析應用和進展第37頁優(yōu)缺點：方法比較準確，但費時，準確性有賴于灌流液中待測物濃度準確性及已知濃度點數(shù)目。微透析應用和進展第38頁低灌注流速法：

在低流速(小于0.05μl/min)條件下,對活體組織進行灌流,即為低灌注流速法。此時,分子質(zhì)量小于500化合物回收率可達95%以上。在極慢灌流速度下,回收率可達100%,所引入誤差可忽略微透析應用和進展第39頁影響微透析回收率原因：溫度灌注速度透析膜物理及化學性質(zhì)探針形狀被分析對象性質(zhì)被分析對象在生物介質(zhì)中擴散速度。微透析應用和進展第40頁應用微透析技術檢測相關物質(zhì)能量代謝物主要包含葡萄糖、乳酸鹽、丙酮酸鹽、腺苷、黃嘌呤等氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)興奮性氨基酸(EAA)包含谷氨酸和天冬氨酸在腦細胞缺血損傷中作用已得到廣泛認同自由基相關物質(zhì)如尿囊素、尿酸等組織損壞標志物如甘油等各種藥品微透析應用和進展第41頁乳酸/丙酮酸比（lactate/pyruvateratio,LPR）

反應由缺血等引發(fā)細胞氧化還原狀態(tài)改變顯著標志。組織缺血時，氧供降低，糖酵解增加，丙酮酸向乳酸轉化增加，LPR隨之升高；伴隨糖含量降低，丙酮酸生成降低，LPR深入增高，缺血惡化。微透析應用和進展第42頁丙三醇

丙三醇是胞膜一個組分。缺血時，能量衰竭可造成胞膜分解，丙三醇釋放入組織間液。丙三醇是組織低氧與細胞破壞有效監(jiān)測指標，增高可提醒缺血腦組織開始惡化。嚴重或完全缺血時，丙三醇能夠升高4～8倍。微透析應用和進展第43頁谷氨酸

興奮毒性是繼發(fā)性腦損傷一個機制，它經(jīng)過谷氨酸介導離子通道開放，引發(fā)細胞大量鈣離子內(nèi)流而造成細胞損傷。腦透析液中谷氨酸增加是細胞損傷直接標志微透析應用和進展第44頁葡萄糖

①缺血：缺血時毛細血管血流降低，轉入透析導管中糖降低。②充血：毛細血管血流增加，轉入導管中糖增加。③高血糖：血糖增高，透析液中糖濃度也增高④高代謝或低代謝：代謝高低可增加或降低糖攝取，影響組織中糖含量，造成分析液中糖濃度增加或降低微透析應用和進展第45頁藥品采取體內(nèi)微透析-毛細管電泳/電化學檢測法(CEEC)測尼古??；Hogan采取微透析-毛細管電泳/激光誘導熒光,用于監(jiān)測一個抗腫瘤藥品在血液中藥代動力學微透析應用和進展第46頁微透析技術在生物學中應用神經(jīng)藥理學研究領域臨床診治中醫(yī)藥研究領域微透析應用和進展第47頁神經(jīng)藥理學研究領域藥效學研究經(jīng)過分析透析液中內(nèi)生神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì),可直接衡量藥品治療效果,有利于探討藥品作用機理。

Hargreaves利用微透析技術監(jiān)測了接收手術去除受損磨牙患者,發(fā)覺預先服用甲基潑尼松龍可使緩激肽釋放降低。微透析應用和進展第48頁神經(jīng)藥理學研究領域藥品代謝研究微透析技術比傳統(tǒng)技術愈加清楚、全方面地反應了藥品在體內(nèi)中間代謝過程。

Scott等應用微透析技術,經(jīng)過監(jiān)測撲熱息痛和它葡糖苷酸濃度-時間改變來研究其藥動學和藥代學微透析應用和進展第49頁神經(jīng)藥理學研究領域藥動學研究早期微透析藥動學研究主要是在中樞神經(jīng)系統(tǒng),最近也有用于其它各種不一樣組織研究報道,而說明中樞藥品作用機制對于研究藥品與血腦屏障關系很有意義。

Tsai等從血液、海馬區(qū)和膽汁3個方面同時使用微透析探針進行了黃芩素藥品動力學研究。微透析應用和進展第50頁臨床診治臨床當前主要包括顱腦損傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血、癲癇、帕金森氏病、腦腫瘤等領域。

國外微透析技術和設備已逐步標準化,被作為一個常規(guī)方法用于神經(jīng)外科手術和神經(jīng)病變監(jiān)護治療,并能提供正常參考值來評價患者透析期間改變,大大降低患者死亡率。有研究顯示,微透析能在患者腦缺血局部腦氧分壓和腦血流量出現(xiàn)改變后5～30min即發(fā)當代謝物濃度改變,早于臨床癥狀,為臨床治療提供更大空間。微透析應用和進展第51頁臨床診治用來選擇具穿透力抗腫瘤化療藥品作為抗微生物藥品“組織穿透力”判定方法。微透析應用和進展第52頁中醫(yī)藥研究領域在腦變性研究方面應用

陳氏等應用微透析發(fā)覺黃芪皂苷不能降低缺血/再灌時谷氨酸釋放。有學者應用腦內(nèi)微透析技術觀察發(fā)覺,丹參經(jīng)過降低半胱氨酸、谷胱甘肽、興奮性氨基酸及NO代謝產(chǎn)物水平發(fā)揮腦保護作用。微透析應用和進展第53頁中醫(yī)藥研究領域在針灸治療方面應用人體經(jīng)絡是一個完整、動態(tài)系統(tǒng),只有在線研究能考查針刺部位所產(chǎn)生一系列生理改變。微透析在線、多靶點監(jiān)測特點全方面反應了考查針刺反應起效部位、微環(huán)境改變,有可能成為詮釋經(jīng)絡、腧穴功效有力工具。

郭氏等采取微透析技術研究發(fā)覺,電針可抑制細胞外興奮性氨基酸過量堆積。微透析應用和進展第54頁經(jīng)穴處Ca2＋濃度高于非經(jīng)穴處。經(jīng)絡穴位處存在Ca、P、K、Fe、Zn、Mn等元素富集現(xiàn)象，Ca元素濃度與P、K、Fe、Zn、Mn等元素有正相關性。結合經(jīng)絡功效和針灸臨床，借助當代科技伎倆，如