微生物之棒狀桿菌

微生物之棒狀桿菌第1頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六內(nèi)容概要棒狀桿菌屬及白喉棒狀桿菌簡介棒狀桿菌與疾病常用種屬鑒定靶點(diǎn)及序列比對(duì)棒狀桿菌毒力因子及序列比對(duì)文獻(xiàn)第2頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六棒狀桿菌屬及白喉棒狀桿菌簡介棒狀桿菌屬(Corynebacterium)是一群革蘭染色陽性桿菌。本屬細(xì)菌的特點(diǎn)是菌體一端或兩端膨大呈棒狀，菌體染色不均勻，可出現(xiàn)異染顆粒。該菌屬無莢膜、無鞭毛，不產(chǎn)生芽胞。種類較多，廣泛分布于動(dòng)、植物?？稍谌梭w皮膚、上呼吸道和泌尿生殖道粘膜等處定居。大多為非致病菌或條件致病菌，其中白喉棒狀桿菌是唯一能引起人類致病且具較強(qiáng)傳染性的菌種。白喉棒狀桿菌的異染顆粒（Albert染色）第3頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六白喉棒狀桿菌(C.diphtheriae)，俗稱白喉?xiàng)U菌，是白喉的病原菌。白喉是一種急性呼吸道傳染病，患者咽喉部粘膜可出現(xiàn)灰白色的假膜。該菌能產(chǎn)生強(qiáng)烈外毒素，進(jìn)入血液可引起全身中毒癥狀。菌體細(xì)長微彎，一端或兩端膨大呈棒狀。細(xì)菌排列不規(guī)則，常排列呈V、L等形狀。革蘭染色陽性。用美藍(lán)短時(shí)間染色菌體著色不均勻，出現(xiàn)有深染的顆粒。用Neisser或Albert等法染色，這些顆粒與菌體著染顏色不同，稱為異染顆。顆粒的主要成分是核糖核酸和多偏磷酸鹽，在鑒定時(shí)有重要意義。但當(dāng)細(xì)菌衰老時(shí)異染顆粒被消耗而不明顯，且細(xì)胞壁變薄易被脫色，常造成革蘭染色不定，有時(shí)可表現(xiàn)為在革蘭陰性的菌體中見有陽性顆?；蚬?jié)段。需氧或兼性厭氧。在血平板上可生長，菌落大小1~3mm。在含有凝固血清的呂氏血清斜面上生長迅速，涂片染色異染顆粒明顯。分離培養(yǎng)時(shí)常用亞碲酸鉀血平板作為鑒別選擇培養(yǎng)基。因亞碲酸鉀能抑制雜菌，而白喉棒狀桿菌不受影響，并能吸收亞碲酸鹽使其還原為黑色的金屬碲，菌落呈黑色。白喉棒狀桿菌在亞碲酸鉀血平板上可形成三種不同形態(tài)特征的菌落，分別稱為重型、輕型和中間型。三型的產(chǎn)毒株與疾病的輕重程度無明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系，但對(duì)流行病學(xué)分析具有一定意義。在我國以輕型多見。白喉棒狀桿菌對(duì)濕熱抵抗力不強(qiáng)，58C10分鐘或煮沸1分鐘死亡。但對(duì)寒冷、干燥和日光的抵抗力較其他無芽胞菌強(qiáng)。在衣服、床單、玩具上可存活數(shù)天至數(shù)周。對(duì)常用消毒劑抵抗力較弱，5%石碳酸1分鐘、3%來蘇爾10分鐘處理可殺滅。對(duì)青霉素、氯霉素、紅霉素等敏感。第4頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六棒狀桿菌與疾病棒狀桿菌種名臨床疾病與癥狀C．diphtheriae臨床上引起白喉，主要侵犯口咽、鼻咽等部位，局部形成灰白色假膜，有咽白喉、喉白喉、鼻白喉和氣管白喉之分。其產(chǎn)生的外毒素可損害心肌和神經(jīng)系統(tǒng)，病死率高，死亡的病例中50%以上是由于心肌受損發(fā)展到充血性心力衰竭所致，可引起心肌炎、軟腭麻痹、聲嘶、腎上腺功能障礙等癥狀。此外，本菌可侵犯眼結(jié)膜、外耳道、陰道和皮膚傷口C．pseudodiphtheriticum偶爾可引起心內(nèi)膜炎、尿路感染、骨感染C．ulcerans可產(chǎn)毒素，引物呼吸道白喉樣疾病，也與奶牛乳腺炎有關(guān)C．a(chǎn)mycolatum可引起心內(nèi)膜炎C．striatum關(guān)節(jié)炎，敗血癥C．jeikeium在免疫抑制或免疫功能不全的人身上引起機(jī)會(huì)性感染，比如骨髓移植中引起的機(jī)會(huì)性感染，也可引起關(guān)節(jié)炎，心內(nèi)膜炎，敗血癥。C．urealyticum可引起泌尿道感染，產(chǎn)生大量尿素酶使尿液變堿，易導(dǎo)致結(jié)石形成。C．xerosis常寄居于眼結(jié)膜，可引起關(guān)節(jié)炎，心內(nèi)膜炎，胸膜肺炎，腹膜炎，骨髓炎，膿毒性關(guān)節(jié)炎，腦膜炎等。C．pseudotuberculosis可引起小反芻動(dòng)物干酪樣淋巴結(jié)炎C．bovis可引起牛乳房炎C．renale引物牲畜膀胱炎和腎盂腎炎C．pyogenes從牛、羊和豬的化膿性損傷中分離到，跟奶牛乳腺炎有關(guān)，人類感染已有報(bào)告.第5頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六常用種屬鑒定靶點(diǎn)及序列比對(duì)靶微生物基因生理功能特異性敏感性備注C.pseudotuberculosis16S[1,11]核糖體RNA假陽性—與C.ulcerans交叉C.diphtheriaeC.ulceranstox[2,5,6,8,9,10,12,13,14]白喉毒素假陰性10copiesperreactiontube某些菌株不含有此基因C.diphtheriaeC.ulceransrpoB[2,11]RNA聚合酶亞基B—10copiesperreactiontubeC.diphtheriaedtxR[3,12]代謝調(diào)節(jié)和毒素合成調(diào)節(jié)因子100%—C.pseudotuberculosisrpoB[4]RNA聚合酶亞基B100%1pg和16S聯(lián)用3重PCR特異性達(dá)100%，敏感性達(dá)1pgC.pseudotuberculosisPld[4]外毒素PLD100%1pg第6頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六靶微生物基因生理功能特異性敏感性備注C.JeikeiumC.urealyticum16S-23S[7]核糖體RNA間區(qū)————16S-23S序列多態(tài)能夠清楚區(qū)分這兩個(gè)種第7頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六種屬鑒定靶點(diǎn)的選定16S作為國際公認(rèn)的細(xì)菌分類“金標(biāo)準(zhǔn)”，作為細(xì)菌屬的鑒定靶點(diǎn)是得到認(rèn)可的，在已下載到的棒狀桿菌文獻(xiàn)中，缺乏關(guān)于棒狀桿菌屬鑒定靶點(diǎn)的描述，介于16S在分類上應(yīng)用的普遍性和權(quán)威性，在此將16S暫定為棒狀桿菌屬的鑒定靶點(diǎn)。代謝調(diào)控因子編碼基因dtxR和RNA聚合酶亞基B編碼基因rpoB是白喉棒狀桿菌鑒定討論最多的靶點(diǎn)，特別是dtxR在白喉的鑒定中表現(xiàn)出良好的特異性，現(xiàn)將dtxR作為白喉的首選鑒定靶點(diǎn)，rpoB作為備選，以區(qū)分白喉和非白喉。換句話說，只要16S顯陽性，排除假陽性的結(jié)果，就認(rèn)為是棒狀桿菌屬的細(xì)菌，再加上dtxR和rpoB顯陽性，排除假陽性結(jié)果，就說明是白喉，如果是陰性就說明是棒狀桿菌的其他種，其他種在這不進(jìn)行細(xì)致的鑒定。第8頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六臨床上棒狀桿菌中的致病種包括白喉棒狀桿菌在內(nèi)，有36個(gè)種，然而在此不可能將數(shù)目眾多的種都考慮進(jìn)去，產(chǎn)毒白喉棒狀桿菌（C．diphtheriae）是最主要的致病種，也是絕對(duì)致病種，在本課題中作為重點(diǎn)考慮，此外，在16S的比對(duì)中將條件致病種C．pseudodiphtheriticum，C．ulcerans，C．a(chǎn)mycolatum，C．striatum，C．jeikeium，C．urealyticum和C．xerosis考慮進(jìn)去，另加跟牛乳腺炎有關(guān)的2個(gè)種：C．bovis和C．pyogenes。第9頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六16S序列比對(duì)選取白喉棒狀桿菌（C.diphtheriae）等10個(gè)種的16S序列進(jìn)行比對(duì)，共計(jì)278條序列。棒狀桿菌屬鑒定16S-1第10頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六由于文獻(xiàn)都是直接用靶基因鑒定到種，沒有用16S屬的鑒定棒狀桿菌屬的引物，屬引物還需自行設(shè)計(jì)。第11頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六dtxR序列比對(duì)選取白喉棒狀桿菌21條dtxR序列進(jìn)行比對(duì)。第12頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六文獻(xiàn)中dtxR引物Targetmicrob序列（5'-3）'Location產(chǎn)物長度(bp)白喉[3]GGGACTACAACGCAACAAGAACAACGGTTTGGCTAACTGTA568-588809-828260第13頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六rpoB序列比對(duì)選取白喉（C．diphtheriae）等9個(gè)種的rpoB序列進(jìn)行比對(duì)，合計(jì)102條。第14頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六文獻(xiàn)中的棒狀桿菌rpoB引物Targetmicrob序列（5'-3）'Location產(chǎn)物長度(bp)C.Pseudotuberculosis[4]CGTATGAACATCGGCCAGGTTCCATTTCGCCGAAGCGCTG2767-27863208-3227446第15頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六棒狀桿菌毒力因子及序列比對(duì)種主要毒力因子相關(guān)基因分布率備注C．diphtheriae白喉毒素（DT）Tox[2,3,5,8,11,12,14，15]54%[5]該種某些菌株不攜帶該毒素，為溶原噬菌體攜帶,A,B兩個(gè)亞基組成,有的菌株只有A亞基，有的只有BC．ulcerans白喉毒素（DT）Tox[2,8,10]11/20[9]A,B兩個(gè)亞基組成外毒素PLD（鞘磷脂酶）PLD[4]__C.pseudotuberculosis外毒素PLD（鞘磷脂酶）PLD[4]100%[4]_第16頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六白喉毒素tox基因比對(duì)選取13株C.diphtheriae的白喉tox基因和15株C.ulcerans的tox基因進(jìn)行比對(duì)。第17頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六文獻(xiàn)中白喉毒素tox引物Targetmicrob序列（5'-3）'Location產(chǎn)物長度(bp)C．Diphtheriae[2]AndC．ulceransTGAAACCCGTGGAAAACGAGACTCTATCTTTGTCTTAGCGTGTCAGGCGATCAGTAGGT(diphtheriae)CTCATTGTCATGCATAAATCTTGAT(ulcerans)576-593713-732643-663666-690156C．DiphtheriaefortoxAsubunit[16]GAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAATCCACTTTTAGTGCGAGAACCTTCGTCA118-137338-366248C．DiphtheriaefortoxBsubunit[16]ATACTTCCTGGTATCGGTAGCCGAATCTTCAACAGTGTTCCA991-10111267-1287297白喉毒素又A,B2個(gè)亞基組成，但某些菌株只存在一種亞基，另一亞基丟失的情況，建議針對(duì)這兩個(gè)亞基分別設(shè)計(jì)1對(duì)引物檢測，方能對(duì)菌株是否含有白喉毒素進(jìn)行準(zhǔn)確定性。第18頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六鞘磷脂酶PLD基因比對(duì)選取10株C.ulcerans的PLD基因進(jìn)行比對(duì)選取17株C.pseudotuberculosis的PLD基因進(jìn)行比對(duì)第19頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六文獻(xiàn)中PLD引物Targetmicro序列（5'-3）'Location產(chǎn)物長度(bp)C.pseudotuberculosis[4]ATAAGCGTAAGCAGGGAGCAATCAGCGGTGATTGTCTTCC506-525689-708203第20頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六參考文獻(xiàn)[1]BurhanC?etinkayaa,*,MuratKarahana,ErayAtila,etal.IdentificationofCorynebacteriumpseudotuberculosisisolatesfromsheepandgoatsbyPCR[J].VeterinaryMicrobiology88(2002)75–83.[2]FabiolaMancini,MonicaMonaco,MarcoPataracchia,etal.IdentificationandmoleculardiscriminationoftoxigenicandnontoxigenicdiphtheriaCorynebacteriumstrainsbycombinedreal-timepolymerasechainreactionassays[J].DiagnosticMicrobiologyandInfectiousDisease73(2012)111–120.[3]FabriciaP.Pimenta,GiseleA.M.Matias,GabrielaA.Pereira,etal.APCRfordtxRgene:Applicationtodiagnosisofnon-toxigenicandtoxigenicCorynebacteriumdiphtheriae[J].MolecularandCellularProbes22(2008)189–192.[4]LuisG.C.Pacheco,RobertaR.Pena,ThiagoL.P.Castro,etal.MultiplexPCRassayforidentificationofCorynebacteriumpseudotuberculosisfrompureculturesandforrapiddetectionofthispathogeninclinicalsamples[J].JournalofMedicalMicrobiology(2007),56,480–486.[5]KetevanKobaidze,TanjaPopovic,1HiroshiNakao,etal.DirectPolymeraseChainReactionforDetectionofToxigenicCorynebacteriumdiphtheriaeStrainsfromtheRepublicofGeorgiaafterProlongedStorage[J].TheJournalofInfectiousDiseases2000;181(Suppl1):S152–5.第21頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六[6]MJPallen,AJHay,LHPuckey,etal.Polymerasechainreactionforscreeningclinicalisolatesofcorynebacteriafortheproductionofdiphtheriatoxin[J].ClinPathol1994;47:353-356.[7]DOMINIQUEAUBEL,FRANCOISN.R.RENAUD,ANDJEANFRENEY,etal.GenomicDiversityofSeveralCorynebacteriumSpeciesIdentifiedbyAmplificationofthe16s-23srRNAGeneSpacerRegions[J].INTERNATIONJOAULRNALOFSYSTEMATBIACCTERIOLOJGuYly,1997,p.767-772.[8]AndreasSing,AnjaBerger,WulfSchneider-Brachert,etal.RapidDetectionandMolecularDifferentiationofToxigenicCorynebacteriumdiphtheriaeandCorynebacteriumulceransStrainsbyLightCyclerPCR[J