RNi技術原理及應用

什么是RNA干擾？RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是指由與靶基因序列同源的雙鏈RNA(double-strandRNA，dsRNA)所誘導的mRNA特異性降解，從而使基因轉錄后沉默的一種現(xiàn)象(FireA,2002)。

2002年美國《科學》雜志將其評為全球年度十大科學進展之首現(xiàn)在是1頁\一共有31頁\編輯于星期一1RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展現(xiàn)在是2頁\一共有31頁\編輯于星期一RNAi的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在是3頁\一共有31頁\編輯于星期一轉錄水平轉錄后水平基因沉默DNA甲基化異染色質形成DNA分子的消融siRNA介導miRNA介導2RNAi的作用機制現(xiàn)在是4頁\一共有31頁\編輯于星期一2.1轉錄水平的基因沉默RNA分子介導的轉錄水平的基因沉默（transicriptionalgenesilencing，TGS）是指基因信息從DNA到mRNA的轉錄過程尚未啟動時，siRNA分子通過修飾染色體DNA分子或與其結合的組蛋白分子阻礙轉錄的發(fā)生現(xiàn)在是5頁\一共有31頁\編輯于星期一2.2轉錄后水平的基因沉默RNA分子介導的轉錄后水平的基因沉默（posttranscriptionalgenesilencing，PTGS）PTGS是指基因信息從DNA到mRNA的轉錄過程啟動后，siRNA分子通過RNA干擾機制降解mRNA或抑制mRNA翻譯，也包括在轉錄啟動后siRNA介導的基因第一外顯子序列的DNA甲基化。現(xiàn)在是6頁\一共有31頁\編輯于星期一2.3RNAi的主要過程起始階段dsRNA(500nt左右最佳)被Dicer酶特異性識別，以一種ATP依賴的方式逐步切割成siRNASmallinterferingRNA(siRNA)長度：21-25ntDicer是一種ATP依賴性RNaseⅢ型核酸內切酶，對單鏈RNA沒有活性，對200~500nt的dsRNA作用效果最好現(xiàn)在是7頁\一共有31頁\編輯于星期一siRNA的結構現(xiàn)在是8頁\一共有31頁\編輯于星期一2.效應階段siRNA誘導沉默復合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）的形成RISC中解旋酶可依靠ATP供能，解開siRNA雙鏈，激活RISC在siRNA反義鏈的指導下(靶序列的識別），RISC中核酸內切酶特異性切割、降解靶mRNA，導致基因表達失活現(xiàn)在是9頁\一共有31頁\編輯于星期一3.siRNA擴增階段RNA依賴性的RNA聚合酶

(RNAdependentRNAPolymerase,RdRp)siRNA可作為引物，以mRNA為模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互補鏈，它在Dicer酶的作用下也被裂解成新生的siRNA。通過這個聚合酶鏈式反應，細胞內的siRNA大大增加，顯著增加了對基因表達的抑制。現(xiàn)在是10頁\一共有31頁\編輯于星期一dsRNA外源dsRNA病毒dsRNA其他dsRNADicer雙鏈siRNAP特異性蛋白結合形成RISCsiRNA解鏈靶序列識別RDRP以siRNA為引物，RDRP催化合成新的dsRNA核酸酶降解mRNAmRNAsiRNARNAi作用機制現(xiàn)在是11頁\一共有31頁\編輯于星期一2.4miRNA介導的RNAiMicroRNAs(miRNAs)是一種大小約為21-25個堿基的非編碼單鏈小分子RNA，是具有發(fā)夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經(jīng)過Dicer酶加工后生成(LeeY,2003)。miRNA的功能也是由RISC介導的，最終引起蛋白質翻譯受抑或者同源mRNA降解（BartelDP.，2004）。現(xiàn)在是12頁\一共有31頁\編輯于星期一Table1.miRNA和siRNA介導RNAi的區(qū)別名稱miRNAsiRNA來源內源轉錄本轉基因病毒RNA前體莖環(huán)狀的pre-miRNA雙鏈結構dsRNA催化酶Dicer或者類似于Dicer的酶復合物Dicer匹配方式不完全互補（動物）或完全互補（植物）完全互補作用目標的專一性（特異性）相對較低高作用點蛋白質合成水平轉錄后水平大小約22nt約22nt功能發(fā)育過程中調節(jié)內源基因表達抑制轉錄活性，病毒感染，表現(xiàn)遺傳靶基因的命運抑制轉錄或者被降解被降解現(xiàn)在是13頁\一共有31頁\編輯于星期一確定目的基因

根據(jù)相對應的核酸序列確定dsRNA模板區(qū)域

獲得dsRNA

用dsRNA轉染細胞

分析RNA干擾的效果3昆蟲RNAi技術的實驗方法RNA干擾研究的一般流程現(xiàn)在是14頁\一共有31頁\編輯于星期一RNAi實驗對照設置對照組設置原理普通陰性對照

與目的基因的序列無同源性和目的靶細胞中其它基因同源性很低熒光標記陰性對照

方便地在熒光顯微鏡下觀察轉染情況可用于優(yōu)化轉染條件和評價轉染效率陽性對照確認RNAi實驗中轉染、RNA提取和基因表達檢測方法是否可靠

LaminA/C、GFP22、

LuciferaseGL2、MAPK1、Beta-Actin、Vimentin、P53、GAPDH、CyclophilinB轉染試劑對照檢測轉染試劑對細胞的毒性、細胞的成活率等細胞轉染的各個因素影響避免Off-target對照針對同一個基因的不同區(qū)域的多個siRNA進行實驗Table2.RNAi實驗對照設置現(xiàn)在是15頁\一共有31頁\編輯于星期一1.dsRNA模板的選擇選擇的dsRNA模板區(qū)域不要針對5’和3’端的非編碼區(qū)通常選擇的模板長度約為500bp在合成dsRNA之前，應該先進行dsRNA和其他mRNA的同源性比對3.1dsRNA的獲得現(xiàn)在是16頁\一共有31頁\編輯于星期一3.2dsRNA的合成方法1.體外轉錄法原理：采用5’-末端含有T7、Sp6或T3RNA多聚酶識別序列的寡核苷酸引物進行PCR擴增目的片段，然后在T7、Sp6或T3RNA多聚酶的作用下轉錄成RNA，通過簡單的退火、核酸酶消化和離心等步驟后即可獲得dsRNA現(xiàn)在是17頁\一共有31頁\編輯于星期一用于制備長度范圍在200bp-1000bp的dsRNA采用Ambion專利的體外轉錄技術，能合成達

50–80μg

的雙鏈RNA試劑盒包括dsRNA純化試劑dsRNA合成－MEGAscript?RNAiKit現(xiàn)在是18頁\一共有31頁\編輯于星期一2.構建RNAi表達載體制備dsRNA

表達載體可分為兩個類型：單啟動子載體，需要插入反向重復DNA（由正義鏈、間隔序列和反義鏈組成），在轉錄的過程中，反向重復序列可產生由內部堿基互補而回折形成的發(fā)夾RNA分子，然后加工形成dsRNA；雙驅動子載體，將靶DNA置入克隆位點后，雙啟動子分別表達正義鏈和反義鏈，然后在胞內結合形成dsRNA現(xiàn)在是19頁\一共有31頁\編輯于星期一單啟動子載體現(xiàn)在是20頁\一共有31頁\編輯于星期一雙驅動子載體——質粒L4440DNA模板（Timmons和Fire，2001）現(xiàn)在是21頁\一共有31頁\編輯于星期一3.3昆蟲RNAi的導入方法dsRNA微量注射法InjectionAdultPupaEmbryoLarvalNanojectIIAuto-NanoliterInjector現(xiàn)在是22頁\一共有31頁\編輯于星期一Table3.昆蟲RNAi的導入方法注射法飼喂法組織培養(yǎng)法操作時期卵、幼蟲、蛹、成蟲幼蟲、成蟲培養(yǎng)細胞、胚胎部分幼蟲操作方法微量注射器dsRNA人工飼料菌液、轉基因dsRNA培養(yǎng)基優(yōu)點dsRNA迅速到達組織精確地導入dsRNA操作容易、省時、經(jīng)濟不造成機械損傷成活率高大量昆蟲同時連續(xù)攝取dsRNA適合用于害蟲控制適用于長期研究操作簡單適用于大規(guī)劃的基因功能篩選缺點操作難度大、耗時成活率較低難于用于大規(guī)模分析基因沉默效率可能較低不同昆蟲由于腸道環(huán)境不同導致dsRNA攝取效率差異較大昆蟲攝取的dsRNA量難于確定基因沉默效率較低需要較高濃度的dsRNA現(xiàn)在是23頁\一共有31頁\編輯于星期一4RNAi技術在昆蟲學研究中的應用

特點：高效、特異性強、快速且經(jīng)濟RNAi技術基因功能研究的優(yōu)點：RNAi技術不破壞基因的完整性，可以先將特定基因的表達封閉，然后再激活可以同時封閉基因家族或具有高度相似性的一組基因，從而解決由于多個基因的功能沉余造成的難于檢測到單個基因突變表型的問題現(xiàn)在是24頁\一共有31頁\編輯于星期一Table4.RNAiresearchonfunctionalgenesininsectsInsectsGenesandReferencesMethodsEffectsSilkwormBombyxmori家蠶Circadianclockgeneper(Sandrellietal.,2007)

Transgenics

Disruptionofegg-atchingEcdysis-triggeringhormonegeneETH(Daietal.,2008)TransgenicsLethalatpharatesecond-instarlarvalstage

EgyptiancottonleafwormSpodopteralittoralisβ-actingene(Gvakhariaetal.,2003)InjectionDisruptionofspermreleaseCircadianclockgeneper(Kotwicaetal.,2009)InjectionDelayedspermreleaseLightbrownapplemothEpiphyasPostvittana蘋果淺褐卷蛾CarboxylesterasegeneEposCXE1andpheromonebindingproteingeneEposPBP1(Turneretal.,2006)FeedingInhibitionofgeneexpressionCottonbollwormHelicoverpaarmigeraCytochromeP450geneCYP6AE14(Maoetal.,2007)FeedingInhibitionoflarvalgrowthGlutathione-S-transferasegeneGST1(Maoetal.,2007)FeedingSuccessfulinhibitionofgeneexpression現(xiàn)在是25頁\一共有31頁\編輯于星期一InsectsGenesandReferencesMethodsEffectsBeetarmywormSpodopteraexiguaChitinsynthasegene(Chenetal.,2008)InjectionDisorderintheinsectcuticle,noexpansionofthelarvaltracheaepithelialwall,andotherlarvalabnormalitiesJapanesepinesawyerMonochamusAlternatus松墨天牛LaccasegeneMaLac2(Niuetal.,2008)InjectionPupalandadultcuticlesclerotisation,deathatahighdoseRedflourbeetleTriboliumcastaneumChitinsynthasegenesTcCHS1andTcCHS2(Arakaneetal.,2005)InjectionDisruptioninalltypesofmoulting(larva-larva,larva-pupa,andpupa-adult),cessationofingestion,decreaseinlarvalsize,andreductionofchitincontentinthemidgutChitinase-likeproteinsTcCHT5,TcCHT10,TcCHT7,andTcIDGF4(Zhuetal.,2008)InjectionEffectsonpupal-adultmoultingEffectsonegghatching,larvalmoulting,pupation,andadultmetamorphosis.Effectsonabdominalcontractionandwing/elytraextension.Effectsonadulteclosion續(xù)Table4.RNAiresearchonfunctionalgenesininsects現(xiàn)在是26頁\一共有31頁\編輯于星期一續(xù)Table4.RNAiresearchonfunctionalgenesininsectsInsectsGenesandReferencesMethodsEffectsWesterncornrootwormDiabroticavirgiferavirgiferaLeConte玉米根螢葉甲

VacuolarATPase(v-ATP)(Baumetal.,2007)FeedingDelayedlarvaldevelopmentandincreasedmortalityStripedfleabeetlePhyllotretastriolataArgininekinasegeneAK(Zhaoetal.,2008)FeedingDelayeddevelopment,increasedmortality,andreducedfertilityMediterraneanfieldcricketGryllusBimaculatus蟋蟀Circadianclockgeneper(Moriyamaetal.,2008)InjectionCompletelossofcircadiancontroloflocomotoractivityandelectricalactivityintheopticlobeNitricoxidesynthasegeneNOS(Takahashietal.,2009)InjectionDestructionoflong-termmemory現(xiàn)在是27頁\一共有31頁\編輯于星期一續(xù)Table4.RNAiresearchonfunctionalgenesininsectsInsectsGenesandReferencesMethodsEffectsGermancockroachBlattellaGermanica德國小蠊BgRXRgene(Martinetal.,2006)InjectionInhibitionofpupaleclosionPigment-dispersingfactorgenepdf(Leeetal.,2009)InjectionEffectsoninsectnightactivityAmericangrasshopperSchistocercaAmericana美洲沙蝗Eyecolourgenevermilion(DongandFriedrich,2005)InjectionSuppressionofommochromeformationandsystematicexpressionBrownplanthopperNilaparvataLugens褐飛虱Trehalosephosphatesynthase(TPS)(NlTPSmRNA)(Chenetal.,2010FeedingDisturbeddevelopmentthroughdisruptionintheTPSenzymaticactivity,reductionofinsectsurvivalrateTurnipsawflyAthaliarosaeArwhitegene(Sumitanietal.,2005)InjectionWhitephenocopyinembryoniceyepigmentation現(xiàn)在是28頁\一共有31頁\編輯于星期一續(xù)表Table4.RNAiresearchonfunctionalgenesininsectsInsectsGenesandReferencesMethodsEffectsEuropeanhoneybeeApismelliferaTranscriptionfactorgeneRelish(SchlünsandCrozier,2007)InjectionInhibitionofRelishgeneexpressionandreductionintheexpressionoftwootherimmunegenes,abaecinandhymenoptaecinTriatomidbugRhodniusprolixus長紅獵蝽Salivarynitrophorin2geneNP2(Araujoetal.,2006)InjectionandfeedingShortenedplasmacoagulationtimeSavannahtsetseflyGlossinamorsitansMorsitans刺舌蠅TsetseEPgeneandtransferringene2A192(Walsheetal.,2009)feedingInhibitionofTsetseEPgeneexpression,butnoinhibitionof2A192geneexpressionEasternsubterraneanTermiteReticulitermesFlavipes東方散白蟻CellulaseenzymegeneCell-1andcasteregulatoryhexamerinstorageproteingeneHex-2(Zhouetal.,2008)feedingReductioningroupfitnessandincreasedmortality現(xiàn)在是29頁\一共有31頁\編輯于星期一TitleTitleTitleInfeedingexperimentsmostsequencesrangebetween300and520bp，ButInthecaseofS2cells,itshouldbeminimally211bp.Thesequenceusedwilldeterminepossibleoff-targeteffectsinthetargetorganism,butalsoinother