基因工程-6章-重組DNA導入受體細胞

2023/4/211載體與目的基因連接后，體系中可能存在下列分子：

a.未連接的載體分子

b.未連接的DNA片段

c.載體的自連

d.含有錯誤插入片段的重組DNA分子

e.重組DNA分子2轉(zhuǎn)化過程中，這些分子同時被轉(zhuǎn)移到宿主細胞內(nèi)。未連接的分子即使被細菌攝取，寄主的酶可降解這些DNA片段。自連的載體和錯誤插入的重組質(zhì)?？梢赃M入宿主細胞進行正常的復制3重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為

分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體

4第六章重組DNA導入受體細胞一、受體細胞二、選擇受體細胞的基本原則三、重組DNA導入受體細胞的方法2023/4/215一、受體細胞受體細胞(receptorcell)又稱為宿主細胞(hostcell)，是指能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細胞。

感受態(tài)(competence)是指細菌吸收外源DNA的生理狀態(tài)。感受態(tài)細胞(competencecell)是指具有接受外源DNA能力的細胞。2023/4/216基因工程常用的受體細胞有:大腸桿菌枯草桿菌土壤農(nóng)桿菌酵母菌植物細胞動物細胞7大腸桿菌81、原核生物細胞的優(yōu)點①大部分原核生物細胞沒有纖維素組成的堅硬細胞壁，便于外源DNA的進入。②沒有核膜，染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，這為外源DNA與裸露的染色體DNA重組減少了麻煩。③基因組簡單，不含線粒體和質(zhì)體基因組，便于對引入的外源基因進行遺傳分析。④原核生物多數(shù)為單細胞生物，容易獲得一致性的實驗材料，并且培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，實驗周期短，重復實驗快。2023/4/219原核生物細胞表達真核生物基因存在的缺點：①原核生物細胞不具備真核生物的蛋白質(zhì)折疊復性系統(tǒng)，即使許多真核生物基因得以表達，得到的也多是無特異性空間結(jié)構(gòu)的多肽鏈。②原核生物細胞缺乏真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，而許多真核生物蛋白質(zhì)的生物活性正是依賴于其側(cè)鏈的糖基化或磷酸化等修飾作用。③原核生物細胞內(nèi)源性蛋白酶易降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白，造成表達產(chǎn)物不穩(wěn)定等。2023/4/2110酵母菌112、酵母菌酵母菌作為外源真核基因表達系統(tǒng)的優(yōu)點①酵母菌是結(jié)構(gòu)最為簡單的真核生物之一,其基因表達調(diào)控機理比較清楚,遺傳操作相對較為簡單。②具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)。③不含有特異性的病毒，不產(chǎn)生毒素，有些酵母菌屬(如釀酒酵母)有著幾百年的應用歷史，屬于安全型基因工程受體系統(tǒng)。④培養(yǎng)簡單，利于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉。⑤能將外源基因表達產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中，便于產(chǎn)物的提取和加工等。2023/4/21123、動物細胞常用的動物受體細胞有Hela細胞、猴腎細胞和中國倉鼠巢細胞(CHO)等。MCF-72023/4/2113哺乳動物細胞作為受體細胞的優(yōu)點是：①能識別和除去外源真核基因中的內(nèi)含子，剪接加工成成熟的RNA。②真核基因表達蛋白在翻譯后能被正確加工或修飾,產(chǎn)物具有較好的蛋白質(zhì)免疫原性,約為酵母細胞16-20倍。③易被重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,具有遺傳穩(wěn)定性和可重復性。④經(jīng)轉(zhuǎn)化的動物細胞可將表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，便于提純和加工，成本低。缺點是:組織培養(yǎng)技術(shù)要求高，如培養(yǎng)和篩選一個高度擴增的轉(zhuǎn)化子CHO細胞，通常需要數(shù)月之久,難度較大。14二、選擇受體細胞的基本原則①便于重組DNA分子的導入。②便于重組體的篩選。③遺傳穩(wěn)定性高，易于進行擴大培養(yǎng)或易于進行高密度發(fā)酵而不影響外源基因的表達效率。對動物細胞而言，所選用的受體細胞具有對培養(yǎng)的適應性強，可以進行貼壁或懸浮培養(yǎng)，可以在無血清培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

2023/4/2115④受體細胞內(nèi)內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)積累，可促進外源基因高效分泌表達。⑤安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染。一般選用致病缺陷型的細胞或營養(yǎng)缺陷型細胞作為受體細胞。2023/4/2116⑥能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細胞中。⑦受體細胞在遺傳密碼子的應用上無明顯偏倚性。⑧具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機制等，便于真核目的基因的高效表達。⑨在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應用價值。2023/4/2117AminoacidRarecodonUrchinHMG1LampreyHMGB1LampreyHMGB2LampreyHMGBXtroutHMG1FrogHMG1TurtleHMGB1ChickHMGB1MouseHMGB1HumanHMGB1HumanHMGB2HumanHMGB3LeuCTA001000001020IleATA100112100000ProCCC367741126334ArgCGG023410121122AGA610044013211AGG542033212232GlyGGA315523223625Total1814181715137816141314稀有密碼子：18三、基因?qū)胧荏w細胞方法轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)導(transduction)轉(zhuǎn)染(transfection)微注射技術(shù)(microinjection)電轉(zhuǎn)化法(electroporation)基因槍技術(shù)(geneblaster)脂質(zhì)體介導法(liposomemediatedtransfer)其他方法：快速冷凍法、碳化硅纖維介導法等。2023/4/211919根據(jù)轉(zhuǎn)移基因載體與受體的特性可分為：質(zhì)粒載體導入受體細胞的方法：CaCl2、電轉(zhuǎn)化法；噬菌體轉(zhuǎn)染細胞的方法：體外包裝感染法；DNA導入酵母菌的方法：電穿孔轉(zhuǎn)化法；DNA導入植物細胞的方法：Ti質(zhì)粒葉盤法、電穿孔轉(zhuǎn)化法、基因槍法；DNA導入昆蟲細胞的方法：桿狀病毒感染法；DNA導入哺乳動物細胞的方法：磷酸鈣共沉淀法、電穿孔轉(zhuǎn)化法、脂質(zhì)體介導法、基因槍法；2023/4/212020轉(zhuǎn)化(transformation):指感受態(tài)的大腸桿菌細胞捕獲質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA分子的過程。轉(zhuǎn)化子(transformant)：經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得外源遺傳物質(zhì)的細胞。轉(zhuǎn)染(transfection):指感受態(tài)的大腸桿菌細胞捕獲噬菌體或以它為載體構(gòu)建的重組DNA分子的過程。轉(zhuǎn)導(transduction):指病毒轉(zhuǎn)移真核細胞DNA的過程或噬菌體介導的細菌細胞之間基因轉(zhuǎn)移的過程。2023/4/21211、氯化鈣轉(zhuǎn)化法（大腸桿菌）●

1970年M.Mandel和A.Hige發(fā)現(xiàn),大腸桿菌經(jīng)過氯化鈣適當處理及短暫熱休克之后,便能吸收λ噬菌體DNA。1972年美國斯坦福大學S.Cohen報道,經(jīng)氯化鈣處理大腸桿菌細胞也能攝取質(zhì)粒DNA。2023/4/2122原理是：細菌處于0℃和低滲氯化鈣溶液中，細菌細胞壁和膜通透性增加,菌體膨脹成球形，此時轉(zhuǎn)化混合物中DNA形成抗DNA酶的羥基-磷酸鈣復合物粘附于細胞表面,經(jīng)短暫熱休克(42℃)后，細胞膜形成許多間隙，DNA進入細胞內(nèi)。如果感受態(tài)細胞做得好，每微克超螺旋質(zhì)粒DNA可得5×107～1×109個轉(zhuǎn)化子。2023/4/21232023/4/2124CaCl2熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞附圖1附圖2252、磷酸鈣-DNA共沉淀法（動物細胞）磷酸鈣-DNA共沉淀法是指外源基因與磷酸鈣混合形成磷酸鈣-DNA共沉淀物，可使DNA附在細胞表面，通過細胞吞入攝取或通過細胞膜脂相收縮時裂開的空隙進入細胞內(nèi)，這種轉(zhuǎn)染方法稱為磷酸鈣-DNA共沉淀法。此方法對于貼壁細胞轉(zhuǎn)染是最常用并首選的方法。

2023/4/2126磷酸鈣-DNA共沉淀法273、共轉(zhuǎn)化（植物細胞）共轉(zhuǎn)化(cotransformation)基因工程中將兩個以上的基因同時導入感受態(tài)真核細胞的方法，又稱共轉(zhuǎn)染。適用于對不帶有可選擇標記性狀的目的基因進行研究。2023/4/2128將目的基因表達載體DNA和標記基因表達載體DNA混合后共同轉(zhuǎn)移到靶細胞中，分別使用標記基因與目的基因?qū)倪x擇劑進行兩次篩選，最后可得到復合轉(zhuǎn)導的轉(zhuǎn)化子。共轉(zhuǎn)化常用的報告基因:胸苷激酶基因(tk基因)、抗新霉素基因(neor)、鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(XGPRT)等。2023/4/21294、電轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化又稱電穿孔法(electroporation):是指在細胞上施加短暫、高壓的電流脈沖，在質(zhì)膜上形成納米大小的微孔，DNA直接通過這些微孔或者作為微孔閉合時所伴隨發(fā)生的膜組分重新分布通過質(zhì)膜進入細胞質(zhì)中，這種方法稱為電穿孔法。最早用于將DNA導入真核細胞,1988年,Dower等人成功應用于大腸桿菌的轉(zhuǎn)化?；驹硎抢酶邏弘娒}沖作用，在大腸桿菌細胞膜上進行電穿孔，形成可逆的瞬間通道,從而促進外源DNA的有效吸收。

2023/4/2130電穿孔轉(zhuǎn)化法的效率受電場強度、電脈沖時間和外源DNA濃度等參數(shù)的影響，通過優(yōu)化這些參數(shù)，每μgDNA可以得到109～1010轉(zhuǎn)化子。電壓增高或電脈沖時間延長時，轉(zhuǎn)化效率將會有所提高，但同時導致受體細胞存活率的降低，轉(zhuǎn)化效率的提高也因此被抵消。2023/4/21312023/4/2132電穿孔法332023/4/21345、基因槍法基因槍法(又稱粒子轟擊法)用高壓氣體加速把粘有DNA的細微金粉(或鎢粉顆粒)打向細胞，穿過細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)等層層構(gòu)造到達細胞核，完成基因轉(zhuǎn)移的方法。基因槍法適用于動植物組織或細胞、胚胎、細菌及小動物等?；驑尫ㄌ攸c：快速、簡便、安全、高效。

2023/4/21352023/4/2136373839406、微注射技術(shù)微注射技術(shù)：一般是用微吸管吸取供體DNA溶液，在高倍倒置顯微鏡下準確地插入受體細胞核中，并將DNA注射進去。常用于轉(zhuǎn)基因動物研究。2023/4/21417、脂質(zhì)體導入法脂質(zhì)體也稱人工細胞膜，是由脂質(zhì)雙分子層組成的，磷脂分子在水中可自動生成閉合的雙層膜,從而形成一種囊狀物被稱為脂質(zhì)體。脂質(zhì)體導入法:將DNA或RNA包囊于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進行脂質(zhì)體與細胞膜的融合，通過融合導入細胞,這種轉(zhuǎn)染方法稱為脂質(zhì)體導入法。2023/4/214243脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染的機制陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹人內(nèi)，形成DNA一脂復合體，也能被表面帶負電荷的細胞膜吸附，再通過膜的融合或細胞的內(nèi)吞作用，偶爾也通過直接滲透作用,將DNA傳遞進入細胞，形成包涵體或進入溶酶體,其中一小部分DNA能從包涵體內(nèi)釋放,并進入細胞質(zhì)中,再進一步進入核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達。

2023/4/2144技術(shù)的憂患1.基因污染：人工組合的基因，可能會通過轉(zhuǎn)基因作物或家養(yǎng)動物擴展到其他栽培作物或自然界野生物種，并成為后者基因的一部分。這就是基因污染。2.基因武器運用遺傳工程技術(shù)，按人們需要，在一些致病細菌或病毒中，接入能對抗普通疫苗或藥物的基因，產(chǎn)生具有顯著抗藥性的致病菌；或者在一些本來不會致病的微生物體內(nèi)接入致病基因，而制造出新的生物制劑。45發(fā)展前景生物學的研究表明，在地球上有許多動物具有很多種優(yōu)良的特性，是我們所不具備而又想具備的（貓頭鷹可以在黑夜看清東西；壁