發(fā)酵工藝學(xué)菌種選育

菌種選育是一門應(yīng)用科學(xué)技術(shù)。理論基礎(chǔ):微生物學(xué)、微生物遺傳學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程等學(xué)科。目的:？現(xiàn)在是1頁\一共有65頁\編輯于星期一菌種選育目的提高產(chǎn)量產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì)改變產(chǎn)品質(zhì)量和組分簡化工藝，縮短周期抵抗不良環(huán)境適應(yīng)新的原材料提供分子遺傳研究材料研究生物合成調(diào)控機(jī)理分析生物合成途徑獲得帶遺傳標(biāo)記的菌株了解菌種遺傳背景生產(chǎn)科研現(xiàn)在是2頁\一共有65頁\編輯于星期一青霉素生產(chǎn)菌種選育1928年，F(xiàn)leming,點青霉2U/mL1943年，一農(nóng)婦的發(fā)霉甜瓜上分離到一株產(chǎn)黃青霉，120U/mL經(jīng)誘變，WisQ176，900U/mL目前工業(yè)發(fā)酵水平：85000U/mL現(xiàn)在是3頁\一共有65頁\編輯于星期一菌種選育的基本內(nèi)容:

根據(jù)菌種自然變異而進(jìn)行的自然選育。用人工方法引起菌種變異或形成新的雜種,再按照工業(yè)生產(chǎn)的要求進(jìn)行篩選來獲的新的變種或雜種。包括誘變育種、雜交育種、原生質(zhì)體育種、基因工程育種?，F(xiàn)在是4頁\一共有65頁\編輯于星期一自然選育概念：利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)突變的原理，通過分離，篩選排除衰退型菌株，選擇維持原有生產(chǎn)水平的菌株的純種選育的方法?，F(xiàn)在是5頁\一共有65頁\編輯于星期一純菌種自發(fā)突變突變個體傳代增殖原始個體菌種為何會退化和變異？現(xiàn)在是6頁\一共有65頁\編輯于星期一1.1菌種退化和變異的原因總的來說：內(nèi)因＋外因遺傳

2.自發(fā)突變的結(jié)果可能原因：

1）沙土管長期保藏2)連續(xù)傳代

3）新陳代謝產(chǎn)生的誘變物質(zhì)

4）增變基因、死亡基因的存在3.經(jīng)誘變劑處理后的退化變異。

現(xiàn)在是7頁\一共有65頁\編輯于星期一生產(chǎn)菌種斜面制備單孢子懸浮液分離出單菌落1.2自然選育流程圖為何進(jìn)行復(fù)篩？生產(chǎn)菌種斜面制備單孢子懸浮液分離出單菌落移種進(jìn)一步選育或保藏斜面種子(初篩)高產(chǎn)菌株沙土管菌株斜面種子搖瓶復(fù)篩高產(chǎn)純化株生產(chǎn)試驗生產(chǎn)菌種斜面制備單孢子懸浮液分離出單菌落自然選育是一種純種選育的方法現(xiàn)在是8頁\一共有65頁\編輯于星期一優(yōu)點：簡單易行缺點：效率低、進(jìn)展慢難以獲得高產(chǎn)突變株

以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種機(jī)率并不很高，一個基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。目的：純化、復(fù)壯菌種現(xiàn)在是9頁\一共有65頁\編輯于星期一§2誘變育種2.1概念：以人工誘變手段誘發(fā)微生物基因突變，改變遺傳結(jié)構(gòu)和功能，通過篩選，從變異體中找出產(chǎn)量高、性狀優(yōu)良的突變株，并找出其最佳培養(yǎng)基和最佳培養(yǎng)條件，使其在最適的環(huán)境條件下合成有效產(chǎn)物?，F(xiàn)在是10頁\一共有65頁\編輯于星期一2.2優(yōu)點：速度快、收效大、方法簡單是當(dāng)前的一種主要方法2.3理論基礎(chǔ)：基因突變(誘發(fā)突變)現(xiàn)在是11頁\一共有65頁\編輯于星期一誘發(fā)突變重要概念突變：由于染色體或基因本身的變化而產(chǎn)生遺傳性狀的變異。表型遲延：表型改變落后于基因型改變的現(xiàn)象。誘變過程現(xiàn)在是12頁\一共有65頁\編輯于星期一突變的誘發(fā)過程

1.誘變劑接觸DNA分子及對DNA分子的損傷

2.DNA損傷的修復(fù)：五種方式

3.從突變到突變型分離性延遲和生理性延遲可理解為“質(zhì)”和“量”

16現(xiàn)在是13頁\一共有65頁\編輯于星期一DNA損傷修復(fù)的五種方式光復(fù)活作用切補(bǔ)修復(fù)重組修復(fù)SOS修復(fù)系統(tǒng)DNA多聚酶的校正作用有利于突變的發(fā)生現(xiàn)在是14頁\一共有65頁\編輯于星期一2.4誘變育種方案設(shè)計制定篩選目標(biāo)誘發(fā)突變常用誘發(fā)劑及其特點誘變劑的選擇

不穩(wěn)定菌株－－－－溫和誘變劑穩(wěn)定菌株－－－－強(qiáng)烈的、廣譜的誘變劑低劑量誘變劑有利于高產(chǎn)菌株的穩(wěn)定性C.突變株的篩選現(xiàn)在是15頁\一共有65頁\編輯于星期一物理誘變劑紫外線、X-射線、

γ-射線、

快中子

特點：紫外線方便、有效、使用安全，其他的幾種射線有一定的穿透力化學(xué)誘變劑

堿基類似物、吖啶類、烷化劑

特點：高效、經(jīng)濟(jì)、但應(yīng)注意使用安全現(xiàn)在是16頁\一共有65頁\編輯于星期一各種誘變的機(jī)制……現(xiàn)在是17頁\一共有65頁\編輯于星期一篩選：將分離培養(yǎng)后的各型單菌落接斜面培養(yǎng)，成熟后接入搖瓶，測定其發(fā)酵生產(chǎn)能力的過程。初篩：以迅速篩出大量的達(dá)到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復(fù)篩：則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主?，F(xiàn)在是18頁\一共有65頁\編輯于星期一2.5誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選現(xiàn)在是19頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是20頁\一共有65頁\編輯于星期一出發(fā)菌株的選擇

1.選擇純種

2.平均發(fā)酵單位要高，且發(fā)酵單位的波動幅度要小，搖瓶間所測得結(jié)果的最高值和最低值之差要小。3.有良好的代謝特性。4.選擇對誘變劑敏感的菌株。5.選用多個出發(fā)菌株進(jìn)行誘變收效較快。

現(xiàn)在是21頁\一共有65頁\編輯于星期一誘變劑的選擇

野生型菌株(遺傳性不穩(wěn)定):用緩和的誘變劑。遺傳性穩(wěn)定的菌株:先要用強(qiáng)烈的不常用的誘變譜廣的誘變劑處理，使其發(fā)生強(qiáng)烈的變異，然后再用緩和的誘變劑進(jìn)行處理或多次自然分離。現(xiàn)在是22頁\一共有65頁\編輯于星期一要考慮誘變劑的作用機(jī)理來選擇誘變劑，兩種誘變劑復(fù)合使用效果好。最適劑量(有2種觀點)：殺菌率90%－99%較好，甚至99.9%;殺菌率75%－85%。

現(xiàn)在是23頁\一共有65頁\編輯于星期一2.6突變株的篩選（Selection）隨機(jī)篩選

(Randomselection)搖瓶篩選法

初篩一般是一個菌株只做一個搖瓶，從大量菌株中選出10-20%較好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而復(fù)篩中搖瓶培養(yǎng)一般是一個菌株培養(yǎng)3瓶，并要重復(fù)3-5次，選出3-5個較好的菌株，再做進(jìn)一步比較，選出最佳的菌株。

復(fù)雜、耗時

現(xiàn)在是24頁\一共有65頁\編輯于星期一瓊脂塊篩選法

簡單、快速，但不準(zhǔn)確自動化篩選（篩選幾千個菌落數(shù)/天）現(xiàn)在是25頁\一共有65頁\編輯于星期一理性化篩選又稱定向篩選

(Orientedselection)

運用遺傳學(xué)、生物化學(xué)的原理，根據(jù)產(chǎn)物已知的或可能的生物合成途徑、代謝調(diào)控機(jī)制和產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)來進(jìn)行設(shè)計和采用一些篩選方法，以打破微生物原有的代謝調(diào)控機(jī)制，獲得能大量形成產(chǎn)物的高產(chǎn)突變株?，F(xiàn)在是26頁\一共有65頁\編輯于星期一反饋：指反應(yīng)鏈中某些中間代謝產(chǎn)物或終產(chǎn)物對該途徑關(guān)鍵酶活性的影響。反饋抑制：指反應(yīng)途徑中某些中間產(chǎn)物或末端產(chǎn)物降低該途徑中前面酶催化的反應(yīng)速度。末端產(chǎn)物的反饋抑制普遍存在于合成途徑。反饋阻遏：代謝的終產(chǎn)物達(dá)到一定濃度時，對該代謝途徑前面的一種酶或幾種酶的生物合成產(chǎn)生阻礙作用?，F(xiàn)在是27頁\一共有65頁\編輯于星期一

普遍存在著反饋抑制和反饋阻遏，要打破反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，可從兩個方面著手：

(1)降低終產(chǎn)物濃度篩選細(xì)胞膜透性改變的突變株例如，谷氨酸發(fā)酵選育的高產(chǎn)菌株為谷氨酸棒桿菌的生物素營養(yǎng)缺陷型。2)初級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選現(xiàn)在是28頁\一共有65頁\編輯于星期一篩選營養(yǎng)缺陷型突變株

營養(yǎng)缺陷型:誘變產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)的能力，須在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。野生型:與營養(yǎng)缺陷型對應(yīng)的是野生型。

滲漏缺陷型:是遺傳性障礙不完全的營養(yǎng)缺陷型，突變使某一種酶的活性下降而不是完全喪失，能少量地合成某一代謝產(chǎn)物?，F(xiàn)在是29頁\一共有65頁\編輯于星期一基本培養(yǎng)基(MM)：能滿足野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基minimalmedium補(bǔ)充培養(yǎng)基(SM)：在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基supplementalmedium完全培養(yǎng)基(CM)：能滿足各種營養(yǎng)缺陷型生長的稱培養(yǎng)基CompleteMemum現(xiàn)在是30頁\一共有65頁\編輯于星期一篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟誘變淘汰野生型檢出缺陷型確定生長譜現(xiàn)在是31頁\一共有65頁\編輯于星期一淘汰野生型抗生素法：由于細(xì)菌或酵母對一些抗生素敏感，在MM中一定量的抗生素，殺死活化狀態(tài)的野生型，保存了休眠狀態(tài)的缺陷型細(xì)菌－青霉素，酵母－制霉菌素菌絲過濾法：對于霉菌，因孢子生長后會長出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過現(xiàn)在是32頁\一共有65頁\編輯于星期一檢出缺陷型原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長情況完全不同，缺陷型在CM上生長良好，而在MM上則不生長，野生型都能生長。

具體方法：影印法、點種法、夾層法

現(xiàn)在是33頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是34頁\一共有65頁\編輯于星期一生長譜測定的方法

將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，制備成細(xì)胞懸液，與MM培養(yǎng)基(融化并涼至50℃)混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的5-6個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營養(yǎng)物的濾紙圓片。培養(yǎng)后會在某組合區(qū)長出，就可測得所需營養(yǎng)。一個平皿測一個菌?，F(xiàn)在是35頁\一共有65頁\編輯于星期一

以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至50℃的MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于各相應(yīng)位置，培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長出可推知其營養(yǎng)因子。在5－6個平皿上可測20株菌以上?，F(xiàn)在是36頁\一共有65頁\編輯于星期一(2)篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株篩選結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株

結(jié)構(gòu)類似物：結(jié)構(gòu)與代謝產(chǎn)物類似的化合物

特點：有反饋調(diào)節(jié)作用

無正常生理功能

篩選方法：濃度梯度法（補(bǔ)充）利用回復(fù)突變篩選抗反饋突變菌株現(xiàn)在是37頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是38頁\一共有65頁\編輯于星期一誘變育種實例：

賴氨酸高產(chǎn)菌株選育現(xiàn)在是39頁\一共有65頁\編輯于星期一天冬氨酸黃色短桿菌的代謝過程甲硫氨酸蘇氨酸賴氨酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸激酶天冬氨酸β－半醛抑制高絲氨酸高絲氨酸脫氫酶(HD)現(xiàn)在是40頁\一共有65頁\編輯于星期一黃色短桿菌的代謝特點天冬氨酸激酶（AK），是一個變構(gòu)酶，并有兩個活性中心，分別受Lys（賴氨酸）、Thr（蘇氨酸）的協(xié)同反饋抑制

協(xié)同反饋抑制：該酶有多個活性中心，抑制物可以分別和某一個特定的活性中心結(jié)合，但是并不影響該酶的活性，只有當(dāng)該酶的所有的活性中心都被抑制物結(jié)合后，其活性才受到抑制。

現(xiàn)在是41頁\一共有65頁\編輯于星期一兩個分支點的優(yōu)先合成機(jī)制：優(yōu)先合成高絲氨酸Hos，再優(yōu)先合成蛋氨酸Met當(dāng)Met過量時阻遏琥珀酰高絲氨酸合成酶，使代謝流向合成Thr的方向進(jìn)行當(dāng)Thr過量時反饋抑制高絲氨酸脫氫酶，使代謝流向Lys的合成上。（Met＞Thr＞Lys）現(xiàn)在是42頁\一共有65頁\編輯于星期一天冬氨酰磷酸天冬氨酸-β-半醛高絲氨酸高絲氨酸磷酸O-琥珀酸高絲氨酸二氫吡啶-2,6-二羧酸賴氨酸蘇氨酸蛋氨酸天冬氨酸現(xiàn)在是43頁\一共有65頁\編輯于星期一育種途徑切斷或減弱代謝支路

切斷或減弱合成Met、Thr的分支途徑——選育營養(yǎng)缺陷型突變株現(xiàn)在是44頁\一共有65頁\編輯于星期一可選用Hos-，其意義在于：

解除了Hos的優(yōu)先合成機(jī)制，阻斷了代謝向Met、Thr的方向進(jìn)行，節(jié)省了原料，可以使Asp-β-半醛這個中間代謝產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)入Lys的生物合成上。

現(xiàn)在是45頁\一共有65頁\編輯于星期一在培養(yǎng)基中限量的供給Met、Thr（或者Hos），對于AK酶活性的調(diào)節(jié)有著重要意義。因為AK酶是一個協(xié)同反饋抑制的變構(gòu)酶，限制了其中某一個抑制物（Thr），則Lys的濃度再高，也不會影響到AK酶的活性，那么，代謝一直向著賴氨酸合成的方向進(jìn)行，使得產(chǎn)物的合成暢通無阻。

現(xiàn)在是46頁\一共有65頁\編輯于星期一雙重營養(yǎng)缺陷型突變株（Met-+Thr-）,其本質(zhì)和Hos-相同。優(yōu)點：遺傳性質(zhì)穩(wěn)定，回復(fù)突變的幾率少?，F(xiàn)在是47頁\一共有65頁\編輯于星期一天冬氨酸人工控制黃色短桿菌的代謝過程生產(chǎn)賴氨酸中間產(chǎn)物Ⅰ天冬氨酸激酶中間產(chǎn)物Ⅱ甲硫氨酸蘇氨酸高絲氨酸高絲氨酸脫氫酶不能合成可以大量積累賴氨酸人工誘變的菌種不能產(chǎn)生現(xiàn)在是48頁\一共有65頁\編輯于星期一解除反饋調(diào)節(jié)（—反饋阻抑）

從理論上講，選育Hom-進(jìn)行賴氨酸發(fā)酵，如果在其培養(yǎng)基中限量供給Thr，則AK酶的活性不會受到Lys的反饋抑制，實際上Lys對AK酶的活性存在一定的抑制作用。因此，對于黃色短桿菌的Lys發(fā)酵，僅僅選育Hom-是不夠的。為了高效率的轉(zhuǎn)化Lys，需要解決這一問題：使該酶（AK）脫敏（就是該酶具有抗反饋抑制或阻遏的能力），如何使其脫敏呢？

現(xiàn)在是49頁\一共有65頁\編輯于星期一選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株？（Xr）

S-L-半胱氨酸抗性突變株AECr

（效果最佳，應(yīng)用最廣）γ-甲基賴氨酸抗性突變株MLrL-賴氨酸氧肟酸鹽抗性突變株LysHxr

蘇氨酸氧肟酸鹽抗性突變株ThrHxr現(xiàn)在是50頁\一共有65頁\編輯于星期一L-Lys:CH2(NH2)-CH2-CH2-CH2-CH(NH2)COOHAEC:CH2(NH2)-CH2-S-CH2-CH(NH2)COOH結(jié)構(gòu)類似物AEC物的作用機(jī)制：起反饋抑制作用

AEC與L-Lys結(jié)構(gòu)相似，被天冬氨酸激酶所誤認(rèn)，與Thr一起在天冬氨酸激酶的變構(gòu)部位上結(jié)合，協(xié)同抑制酶活。抗結(jié)構(gòu)類似物突變株的實質(zhì)：天冬氨酸激酶編碼的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變?，F(xiàn)在是51頁\一共有65頁\編輯于星期一1、篩選營養(yǎng)缺陷型突變株。2、篩選抗性突變突變株

磷酸鹽、碳源調(diào)控菌株。

氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株

二級金屬離子抗性突變菌株篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株

篩選自身代謝產(chǎn)物抗性突變株

抗噬菌體、溫度敏感等

現(xiàn)在是52頁\一共有65頁\編輯于星期一次級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選1、篩選營養(yǎng)缺陷型突變菌株（分支合成途徑）氯霉素合成途徑氯霉素由莽草酸途徑合成，同時還有芳香族氨基酸，會產(chǎn)生反饋抑制。通過誘變篩選，阻斷莽草酸到芳香族氨基酸的途徑，可增加氯霉素的產(chǎn)量。氯霉素現(xiàn)在是53頁\一共有65頁\編輯于星期一2、篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株許多抗生素等次級代謝產(chǎn)物的生物合成明顯受到磷酸鹽的調(diào)控，當(dāng)培養(yǎng)基中磷酸鹽的含量超過一定限度，這種代謝產(chǎn)物的合成就受到明顯的抑制作用。通過固體瓊脂塊發(fā)酵，加入過量磷酸鹽，觀察抑菌圈的大小。現(xiàn)在是54頁\一共有65頁\編輯于星期一3、篩選去除碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株許多能被菌株快速利用的碳源往往對許多次級代謝產(chǎn)物的合成產(chǎn)生阻遏或抑制作用。青霉素發(fā)酵中的葡萄糖效應(yīng)不但抑制抗生素的生物合成，而且抑制某些碳氮源的分解利用。由于葡萄糖對菌體內(nèi)的分解氮源的酶產(chǎn)生抑制作用，使菌體不能分解利用唯一的氮源組氨酸，菌體不能生長。誘變菌株，涂布到組氨酸和葡萄糖的培養(yǎng)基上原因：葡萄糖分解代謝的酶發(fā)生了變化，不再產(chǎn)生和積累分解代謝阻遏物。現(xiàn)在是55頁\一共有65頁\編輯于星期一例2篩選葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物抗性突變菌株利用葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物2-脫氧葡萄糖，不能被菌體利用，但具有葡萄糖的碳源分解產(chǎn)物阻遏作用，在用乳糖和2-脫氧葡萄糖為碳源，阻遏乳糖利用，篩選少量生長菌落。現(xiàn)在是56頁\一共有65頁\編輯于星期一4、篩選氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株許多次級代謝物都是以初級代謝產(chǎn)物如氨基酸等做為前體生物合成這些次級代謝產(chǎn)物。當(dāng)這種氨基酸前體成為次級代謝產(chǎn)物生物合成的限制因素的時候，篩選這種氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株，解除這種氨基酸的反饋調(diào)節(jié)，可提高氨基酸的胞內(nèi)量，進(jìn)而提高代謝產(chǎn)物的合成?，F(xiàn)在是57頁\一共有65頁\編輯于星期一例1、青霉素合成途徑中，半胱氨酸和纈氨酸是生物合成青霉素母核的前體，篩選抗半胱氨酸結(jié)構(gòu)類似物或抗酰胺酸結(jié)構(gòu)類似物的抗性突變株，可提高半胱氨酸或纈氨酸的生成量，進(jìn)而提高青霉素產(chǎn)量?，F(xiàn)在是58頁\一共有65頁\編輯于星期一5、篩選二價金屬離子抗性突變株過量的二價金屬離子對菌體有毒害，有些次級代謝產(chǎn)物可以與二價金屬離子形成鹽，降低金屬離子的毒害作用，代謝產(chǎn)物越多，解毒作用越強(qiáng)。誘變后涂布到高濃度二價離子培養(yǎng)基上，能長出來的可能是高產(chǎn)菌株（細(xì)胞膜通透性菌株剔除），進(jìn)一步搖瓶篩選。桿菌肽和青霉素：桿菌肽可以與二價離子結(jié)合將過量的金屬離子帶出體外。在培養(yǎng)基中加入大量的硫酸亞鐵，硫酸鋅。現(xiàn)在是59頁\一共有65頁\編輯于星期一6、篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株前體是能夠直接被菌體合成代謝產(chǎn)物而自身的分子結(jié)構(gòu)沒有顯著改變的物質(zhì)。前體在提高產(chǎn)量的同時也會對菌體產(chǎn)生毒性。篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物的抗性突變株可以消除前體對產(chǎn)生菌的毒性作用，提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。例如：灰黃霉素發(fā)酵使用氯化物為前體，但是高濃度氯化物有抑制作用。篩選抗氯化物的突變株，可提高灰黃霉素的產(chǎn)量?，F(xiàn)在是60頁\一共有65頁\編輯于星期一例2、苯氧乙酸為青霉素V的前體，篩選抗苯氧乙酸的突變株。例3、纈氨酸是青霉素的前