經(jīng)濟學第二節(jié)其他重要工具酶

經(jīng)濟學第二節(jié)其他重要工具酶DNA聚合酶（DNApolymerase）DNA聚合酶是催化以DNA或RNA為模板合成DNA的一類酶的總稱。經(jīng)常使用的DNA聚合酶有大腸桿菌DNA聚合酶I()、Klenow酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、耐高溫的TaqDNA聚合酶以及反轉(zhuǎn)錄酶等。這些DNA聚合酶的共同特點是：它們都能夠把脫氧核糖核苷酸(dNTP，包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP)連續(xù)的加到雙鏈DNA引物鏈的3'-羥基末端上，催化核苷酸的聚合，形成新的DNA鏈。DNA聚合酶IDNA聚合酶I具有三種活性，即5→3聚合活性、5→3外切活性和3‘→5’外切活性。DNA聚合酶

I要發(fā)揮作用需滿足以下三個條件。①底物和激活劑：DNA聚合酶

I催化聚合反應需要四種dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)作為底物，同時Mg2＋是不可缺少的激活劑。②帶有3-端羥基末端的引物：DNA聚合酶

I所催化的聚合反應總是在引物的3-OH末端基團和攙入的dNTP之間發(fā)生的，且只能沿引物末端由5→3方向延伸。③DNA模板：可以是ssDNA或dsDNA，后者只有在其主鏈上有一至數(shù)個斷裂的情況下才能成為有效的模板。實驗室中，利用

DNA

聚合酶I，通過DNA缺口平移的方法制備DNA

探針，可以用于核酸雜交分析。雙鏈DNA

的單鏈缺口在DNA

聚合酶I的5→3外切作用下，從缺口的5‘端逐步水解核苷酸時，酶的聚合活性則利用缺口的3’端游離羥基逐個加上相應的單核苷酸，使得缺口向下游移動，這種缺口移動的現(xiàn)象就稱為缺口平移。如果反應中使用的是用同位素標記過的單核苷酸底物，則合成產(chǎn)生的DNA分子即可作為帶放射性標記的DNA分子雜交探針。DNA聚合酶IDNA聚合酶I大片段(Klenow片段)是E.coliDNA

聚合酶I

的蛋白水解產(chǎn)物，特點是：具有DNA

聚合酶活性和3→5核酸外切酶活性，但缺失了5’→3’核酸外切酶活性。Klenow

既保留了全酶的高保真性，又不會降解DNA5末端。用途：在基因工程中主要用于切口平移法標記DNA，同時也可用于DNA

的缺口補平和延伸。用途：用隨機引物制備探針補平5突出端，形成平末端切除3突出端，形成平末端合成cDNA第二條鏈誘變反應中第二條鏈的合成雙脫氧法DNA序列測定(Sanger法)DNA

聚合酶I大片段(Klenow片段)DNA

聚合酶I大片段(Klenow片段)T4DNA

聚合酶在模板及引物存在的條件下，T4DNA

聚合酶催化沿5'→3'方向合成DNA。此酶還具有3'→5'外切核酸酶的活性，該活性比DNA

聚合酶I強。與E.coliDNA

聚合酶I

不同，T4DNA

聚合酶不具有5'→3'外切核酸酶活性。T4DNA

聚合酶■

缺口填充(無鏈置換活性)

■

產(chǎn)生平末端的最佳用酶

■

補平5'突出端，形成平末端

■

切除3'突出末端，形成平末端

■

通過置換合成法標記探針

■

單鏈刪除后亞克隆

■

基因定點突變中第二條鏈的合成DNA片段的末端平滑化示例T7DNA聚合酶T7DNA聚合酶是從受T7噬菌體感染的大腸桿菌寄主細胞中純化出來的一種復合形式的核酸酶。它由兩種亞基組成：一種是T7噬菌體基因5編碼的蛋白質(zhì)，其分子量為84kD；另一種是大腸桿菌編碼的硫氧還蛋白(thioredoxin)，其分子量為12kD。T7DNA聚合酶是目前已知的持續(xù)合成能力最強的DNA

聚合酶，能連續(xù)合成數(shù)千個核苷酸。除聚合活性以外，T7DNA

聚合酶還具有單鏈和雙鏈的3‘→5’外切酶活性，它的活性也很強，約為Klenow

酶的1000倍。T7DNA聚合酶不具有5‘→3’外切酶活性。由于T7DNA聚合酶的高度續(xù)進性和不受DNA二級結(jié)構(gòu)的影響，在分子生物學中常被用于長模板DNA的引物延伸反應。同時，經(jīng)修飾的T7DNA聚合酶還是雙脫氧終止法對長片段DNA進行測序的理想工具酶。T7DNA

聚合酶

堿性磷酸酶（AlkalinePhosphatase）

堿性磷酸酶是一類能特異性地切去DNA或RNA的5‘-磷酸基團的工具酶，它們的作用底物可以是ssDNA或dsDNA或RNA，也可以是NTP或dNTP。用途1）去除DNA片段的5’-末端的磷酸基。防止線狀DNA的自身環(huán)化（Self-Ligation）。

2）除去PCR反應后殘存的dNTP。PCR產(chǎn)物進行測序時，在反應體系中如果有多余的Primer和dNTP，將影響測序反應的正常進行。使用ExonucleaseI分解殘存的Primer；用SAP處理可降解多余的dNTP，之后不需要對PCR產(chǎn)物進行精制，立即可以進行測序反應。從細菌中分離的堿性磷酸酶(AlkalinePhosphatase,E.coli

C75;

BAP)從小牛腸中分離的堿性磷酸酶(Alkalinephosphase,calfintestinal,CAP)。從蝦提取的蝦堿性磷酸酶（ShrimpAlkalinePhosphatase，SAP）

堿性磷酸酶

堿性磷酸酶T4多聚核苷酸激酶（T4polynucleotidekinase，PNK）

DNA或RNA5'末端的磷酸化，以便進行連接反應。DNA或RNA的末端標記，用作探針和進行DNA測序。

雙鏈DNA片段的磷酸化在微量離心管中配置溶液如下：37℃反應3min,70℃反應5~10分鐘使酶失活。進一步用酒精沉淀的方法精制DNA。T4polynucleotidekinase2μlATP(10mM)5μl10reactionbuffer5μl雙鏈DNA片段10pmol

超純水補足50μlDNA

酶

I

（DNase）DNA酶I（DNaseI）是隨機水解雙鏈或單鏈DNA的一種內(nèi)切酶，使DNA分子降解成帶有5‘磷酸末端的單核苷酸和寡核苷酸的混合物。進行重組DNA研究時，必須注意防止DNA酶的污染，否則制備的DNA樣品將會降解。因此使用的器皿或試劑要高溫處理，樣品中需加EDTA，或放置冰上以破壞或抑制酶活性。

用途1）與DNAPolymeraseI

一起用于切口平移（Nicktranslation）。2）在Mn2+存在的條件下，為鳥槍法測序（Shotgunsequencing）制作DNA文庫。3）用于足跡法（Footprinting）分析DNA-蛋白質(zhì)相互作用。4)DNaseI

可以作用于單鏈

DNA、雙鏈DNA、染色質(zhì)和RNA:DNA雜交鏈。RNA酶A（RibonucleaseA）

RibonucleaseA是一種內(nèi)切核糖核酸酶，可在C和U殘基位置特異性降解單鏈RNA。該酶可以切割核苷上5’-核糖與鄰近嘧啶核苷3’-核糖上磷酸基團之間的磷酸二脂鍵。產(chǎn)生的2’，3’-環(huán)磷酸可以水解成相應的3’-核苷磷酸鹽。

產(chǎn)品用途：質(zhì)粒和基因組DNA制備時用于去除RNA；重組蛋白質(zhì)制備過程中，除去溶液中的RNA。質(zhì)粒提取后用RNA酶處理其它的RNA酶RNA酶T1只作用于鳥嘌呤核苷酸的3‘磷酸根，切開與其相鄰核苷酸連接的5’磷酸鍵；

RNaseH

可以降解DNA-RNA雜交鏈中的RNA分子。防護RNA酶的污染人體的分泌物如唾液、汗液中都含有RNA酶。因此在操作RNA樣品時，必須戴手套，實驗用的玻璃器皿都要經(jīng)250℃烘烤4h(RNA酶耐熱)，或用RNA酶的抑制劑處理。末端轉(zhuǎn)移酶的主要用途末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶簡稱末端轉(zhuǎn)移酶，分子量為60kD，來源于前淋巴細胞和分化早期的類淋巴樣細胞。在二價陽離子的存在下，該酶能夠逐個地將脫氧核苷酸分子加到線性DNA分子的3'-OH末端。末端轉(zhuǎn)移酶在反應過程中不需要模板的存在。對不同的dNTP所需要的二價陽離子不同，若加入的核苷酸是嘧啶核苷酸，則Co2+為首選陽離子；如果加入的核苷酸是嘌呤核苷酸，則Mg2+為首選陽離子。當反應體系中只有一種dNTP時，就可以在DNA分子的3′末端加上同聚物尾巴(homopolymerictail)。末端轉(zhuǎn)移酶的主要用途分別給外源DNA片段和載體分子加上互補的同聚物尾巴，以使它們可以連接起來。例如：可以給用做克隆載體的線性DNA

分子的3'-OH

末端加上poly(dT)尾巴，給待克隆的外源DNA

片段的3'-OH

末端加上poly(dA)尾巴。然后將外源DNA

連接于載體中，形成重組DNA分子。末端轉(zhuǎn)移酶的主要用途DNA連接酶

作用機制及特點DNA連接酶(DNAligase)能利用NAD+或ATP中的能量，催化多段DNA的3‘羥基和5’磷酸末端之間形成3‘，5’-磷酸二酯鍵，把兩個DNA片段連接在一起，封閉DNA雙鏈上形成的切口(見圖3-3)。連接酶和限制酶一樣是基因工程中不可缺少的重要工具。應當注意，DNA連接酶只能連接雙鏈DNA分子的單鏈切口(nick)，既不能催化兩條單鏈DNA分子的連接(T4DNA連接酶例外)，也不能催化雙鏈中一個或多個核苷酸缺失所造成的缺口(gap)。DNA連接酶的分類常用的DNA連接酶有T4DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶兩種。在這兩種連接酶中，最常使用的是T4DNA連接酶，它的連接效率高，既可用于黏性末端的連接，也可用于平齊末端的連接。一般來說，片段越小，末端黏性越強，連接反應則可使用較高的溫度。DNA平齊末端的連接比黏性末端連接效率低得多。平齊末端的連接一般需要在10～20℃進行，且需要較高的DNA濃度和T4DNA連接酶的濃度。而黏性末端的連接一般在16～26℃進行。大腸桿菌

DNA

連接酶催化的連接反應中所需要的能量由NAD+提供，

T4DNA連接酶催化的反應中所需要的能量由ATP

提供。其他方面大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA

連接酶的作用機制相同。

各種連接酶特性的比較

反轉(zhuǎn)錄酶商品化的反轉(zhuǎn)錄酶有兩種，一種來自禽成髓細胞瘤病毒(AMV)，另一種來自大腸桿菌中表達的Mo