細(xì)胞融合定稿

細(xì)胞融合定稿第1頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六細(xì)胞融合的應(yīng)用領(lǐng)域

細(xì)胞融合（cellfusion)

是細(xì)胞工程技術(shù)的重要手段之一，是研究細(xì)胞遺傳、基因定位、細(xì)胞免疫、病毒和腫瘤的重要手段。第2頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六顯微鏡下細(xì)胞融合過程第3頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六融合過程中兩個(gè)細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋的變化過程圖解第4頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六融合的助融劑依據(jù)融合過程采用的助融劑不同，細(xì)胞融合可分為：病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞融合，如仙臺(tái)病毒（HVJ）；化學(xué)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞融合，如聚乙二醇（PEG）；電場(chǎng)誘導(dǎo)的細(xì)胞融合；激光誘導(dǎo)的細(xì)胞融合第5頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過程示意圖第6頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饩垡叶迹≒EG）誘導(dǎo)體外細(xì)胞融合的基本原理。通過PEG誘導(dǎo)雞血細(xì)胞之間的融合實(shí)驗(yàn)，初步掌握細(xì)胞融合的基本方法。第7頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)原理PEG是乙二醇的多聚化合物，可改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處脂類分子發(fā)生疏散和重組，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞融合。商品PEG存在一系列不同分子質(zhì)量的多聚體，一般應(yīng)用PEG4000~6000的溶液，能夠產(chǎn)生高頻率的細(xì)胞融合。第8頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。缺點(diǎn)：是融合過程繁瑣，PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害。

第9頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合過程第10頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)儀器、用具注射器滴管燒杯容量瓶載玻片離心機(jī)水浴鍋顯微鏡酒精燈蓋玻片第11頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六試劑Hanks原液（10×）NaCl280.0gNa2HPO4·12H2O1.2gKCl4.0gKH2PO40.6gMgSO4·7H2O2.0g葡萄糖10.0gCaCl21.4g第12頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六試劑Hanks原液（10×）稱取1.4gCaCl2，溶于30-50ml蒸餾水中取1000mL的燒杯及容量瓶各1個(gè)，先放重蒸水800mL于燒杯中，然后按上頁(yè)表順序逐一溶解藥品。直到葡萄糖完全溶解后，再將已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水定容至1000mL第13頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六試劑Hanks液Hanks原液100mL重蒸水896mL0.5%酚紅4mL配好的Hanks液，分裝包扎好貼上標(biāo)簽，經(jīng)過滅菌后，4℃保存。第14頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六試劑生理鹽水50%（m/V）PEG溶液稱取0.5克PEG(MW=4,000)放入試管內(nèi)，在酒精燈上融化之，迅速加入1ml預(yù)熱的Hanks液混勻制成50％的PEG溶液。放入37℃水浴中待用。第15頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六方法與步驟1.雞血細(xì)胞儲(chǔ)備液的制備（已完成）取雞血，加入肝素（100U/5mL全血）制成抗凝全血。再加入4倍體積生理鹽水，制成紅細(xì)胞儲(chǔ)備液2.雞血細(xì)胞的處理用5mL離心管取雞血細(xì)胞儲(chǔ)備液1mL，加入4mL生理鹽水，混勻后，800rpm離心5min，棄上清，用5mL生理鹽水重懸浮沉淀，重復(fù)離心操作1次。第16頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六方法與步驟3.雞血細(xì)胞懸液的制備在離心后的雞血細(xì)胞沉淀中加入2mlHanks緩沖液，將細(xì)胞懸浮，于37℃保溫。4.PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合吸取1mL雞血懸液放在10mL離心管中，逐滴加入37℃的50%PEG約0.5mL,邊加邊輕輕搖動(dòng)，1min加完，混勻后于37℃水浴靜置3min。第17頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六方法與步驟5.終止PEG作用緩慢加入5mLHanks緩沖液，輕輕吹打混勻，于37℃水浴中靜置5min。6.制備細(xì)胞懸液用吸管輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)數(shù)次使其分散，離心使細(xì)胞沉淀，用1-2mLHanks緩沖液重懸浮。7.鏡檢吸取細(xì)胞懸液，在凹面載玻片上滴一滴，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察細(xì)胞融合情況。第18頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六注意事項(xiàng)溫度、融合時(shí)間、PEG的濃度與作用時(shí)間、細(xì)胞密度、機(jī)械力等因素均影響融合率，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)予以注意，并在需要的時(shí)候及時(shí)鏡檢。第19頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)結(jié)果第20頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六計(jì)算細(xì)胞融合率細(xì)胞融合率是指在顯微鏡的視野內(nèi)，已發(fā)生融合細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù)與該視