醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座

一、人員資質及培訓要求

從事醫(yī)療器械微生物檢驗工作人員應具備微生物學或相近專業(yè)知識教育背景。檢驗人員應依據所在崗位和職責接收對應培訓，在確認它們能夠負擔某一檢驗前，他們不能獨立從事該項微生物檢驗。應確保全部些人員在上崗前接收勝任工作所必須設備操作、微生物檢驗技術和試驗室生物安全等方面培訓，經考評合格后方可上崗，同時，試驗室應制訂全部級別試驗人員繼續(xù)教育計劃。檢驗人員必須熟悉相關監(jiān)測方法、程序、檢驗目標和結果評價。微生物試驗室管理者其專業(yè)技能和經驗水平應與他們職責范圍相符，如：管理技能、試驗室安全、檢驗安排、預算、試驗研究、試驗結果評定和數(shù)據偏差調查、技術匯報書寫等。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第1頁

二、試驗室環(huán)境控制【標準】試驗室布局設計基本標準是既要最大可能預防微生物污染，又要預防檢驗過程對環(huán)境和人員造成危害。通常，試驗室應劃分成潔凈或無菌區(qū)域和活菌操作區(qū)域，同時應依據試驗目標，在時間或空間上有效分隔不相容試驗活動，將交叉污染風險降低到最低。普通情況下，醫(yī)療器械微生物檢驗試驗室應含有開展無菌檢驗、微生物程度檢驗等檢測活動、獨立設置潔凈室（區(qū)）或隔離系統(tǒng)，并為上述檢驗配置對應細菌（真菌）等試驗室、培養(yǎng)室、文檔處理區(qū)等輔助區(qū)域，同時，應對上述區(qū)域明確標識。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第2頁二、試驗室環(huán)境控制【要求】1、無菌檢驗應在環(huán)境潔凈度10000級下局部潔凈度100級單向流空氣區(qū)域內或隔離系統(tǒng)中進行。用于無菌檢驗和微生物程度檢驗潔凈操作室應配有屬于“人流凈化”更衣室及屬于“物流凈化”緩沖間或傳遞窗（柜），使進入潔凈操作室試驗人員和試驗物品分別經適當凈化后進入試驗操作間。無菌室分無菌操作室和緩沖間。無菌操作室應含有空氣除菌過濾單向流空氣裝置。操作室或工作臺應保持正壓。應在壓差十分主要相鄰級別區(qū)之間安裝壓差表。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第3頁二、試驗室環(huán)境控制【要求】2、微生物程度檢驗全過程，均應恪守無菌操作，嚴防再污染。所以，微生物程度檢驗宜在環(huán)境潔凈度10000級下局部潔凈度100級單向流空氣區(qū)域內進行；程度檢驗試驗室應配有對應人流和物流緩沖間，并定時作環(huán)境監(jiān)測。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第4頁二、試驗室環(huán)境控制

【要求】

3、菌種處理、微生物判別和陽性對照室菌種處理包含內容比較多，如菌種傳代、保藏、制備以及培養(yǎng)基促生長試驗、陽性對照、微生物方法驗證、消毒劑和防腐劑效力測定和對環(huán)境中分離菌判別等，這些試驗過程中都在處理活微生物，處理不妥會造成試驗室環(huán)境污染，影響其它試驗結果，所以，該室必須與其它試驗室嚴格分開；必要時，應按試驗室性質需要保持對相鄰試驗室相對壓差；需采取必要消毒方式確保試驗室潔凈條件合格（如臭氧，乳酸熏蒸等），以凈化層流臺作為局部100級控制辦法，最好是使用生物安全柜，全部與活毒菌種相關活動都應在層流臺或生物安全柜中進行。每次試驗結束后要對層流臺或生物安全柜及整個試驗室環(huán)境進行消毒。全部與菌種相關試驗廢物均應經過滅菌處理后方可丟棄。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第5頁二、試驗室環(huán)境控制【要求】4、培養(yǎng)室及其它功效間培養(yǎng)室用于放置培養(yǎng)細菌和真菌培養(yǎng)箱。準備區(qū)即試液及培養(yǎng)基配制/滅菌區(qū)域、試驗器皿洗滌、烘干、滅菌、試驗用具及易耗品儲備等沒有特殊要求功效間，可為普通清潔環(huán)境。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第6頁微生物環(huán)境控制相關標準GB/T16292:，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮粒子測試方法GB/T16293:，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))浮游菌測試方法GB/T16294:，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))沉降菌測試方法GB50073-潔凈廠房設計規(guī)范ISO14644-1:1999潔凈室及相關受控環(huán)境第1部分：空氣潔凈度等級劃分ISO14644-4:1999潔凈室及相關受控環(huán)境第4部分：設計、施工、運行ISO14644-7:1999潔凈室及相關受控環(huán)境第7部分：分離設備醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第7頁無菌室環(huán)境控制設備微粒計數(shù)儀醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第8頁無菌室環(huán)境控制設備浮游菌采樣儀醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第9頁無菌室環(huán)境控制設備醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第10頁潔凈室沉降菌測試方法1.測試時間1.1對單向流，如100級凈化房間及層流工作臺，測試應在凈化空調系統(tǒng)正常運行不少于10min后開始。1.2對非單向流，如10000級、100000級以上凈化房間，測試應在凈化空調系統(tǒng)正常運行不少于30min后開始。2.采樣方法將已制備好培養(yǎng)皿按要求放置，打開培養(yǎng)皿蓋，使培養(yǎng)基表面暴露0.5h，再將培養(yǎng)皿蓋蓋上后倒置。2.2.培養(yǎng)全部采樣結束后，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在30℃～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時間不少于48h。每批培養(yǎng)基應有對照試驗，檢驗培養(yǎng)基本身是否污染?？擅颗x定3只培養(yǎng)皿作對照培養(yǎng)。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第11頁潔凈室沉降菌測試方法3.菌落計數(shù)用肉眼直接計數(shù)，標識或在菌落計數(shù)器上點計，然后用5～10倍放大鏡檢驗，有否遺漏。若培養(yǎng)皿上有2個或2個以上菌落重合，可分辨時仍以2個或2個以上菌落計數(shù)。4.注意事項4.1測試用具要作滅菌處理，以確保測試可靠性、正確性。4.2采取一切辦法預防人為對樣本污染。4.3對培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及其它參數(shù)作詳細統(tǒng)計。4.4因為細菌種類繁多，差異甚大，計數(shù)時普通用透射光于培養(yǎng)皿后面或正面仔細觀察，不要漏計培養(yǎng)皿邊緣生長菌落，并須注意細菌菌落與培養(yǎng)基沉淀物區(qū)分，必要時用顯微鏡判別。4.5采樣前應仔細檢驗每個培養(yǎng)皿質量，如發(fā)覺變質、破損或污染應剔除。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第12頁潔凈室沉降菌測試方法5.測試規(guī)則5.1.測試狀態(tài)5.1.1沉降菌測試前，被測試潔凈室（區(qū)）溫濕度須到達要求要求，靜壓差、換氣次數(shù)、空氣流速必須控制在要求值內。5.1.2沉降菌測試前，被測試潔凈室（區(qū)）已經過消毒。5.1.3測試狀態(tài)有靜態(tài)和動態(tài)兩種，測試狀態(tài)選擇必須符合生產要求，并在匯報中注明測試狀態(tài)。5.2.測試人員5.2.1測試人員必須穿戴符合環(huán)境潔凈度級別工作服。5.2.2靜態(tài)測試時，室內測試人員不得多于二人。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第13頁最少采樣點數(shù)目面積潔凈度級別10010000100000<102～322≥10～＜20422≥20～＜40822≥40～＜1001642≥100～＜20040103≥200～＜40080206≥400～＜10001604013≥1000～＜4001003280020063注：表中面積，對于單向流潔凈室.指是送風面積；對非單向流潔凈室，指是房間面積醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第14頁同時滿足最少平皿數(shù)潔凈度級別所需Φ90mm培養(yǎng)皿數(shù)（以沉降0.5h計）100級1410000級2100OOO級2醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第15頁采樣點布置采樣點位置能夠同懸浮粒子測試點。a）工作區(qū)采樣點位置離地0.8m～1.5m左右（略高于工作面）。b）可在關鍵設備或關鍵工作活動范圍處增加采樣點。采樣點位置詳細規(guī)則見附錄B（標準附錄）。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第16頁采樣點布置醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第17頁潔凈度級別沉降菌浮游菌塵粒最大允許數(shù)/m3個/（Φ90mm）0.5h）活微生物數(shù)/m3≥0.5μm≥5μm100≤1≤5≤3500－10000≤3≤100≤350000≤環(huán)境檢測參照標準醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第18頁微生物試驗室管理嚴格區(qū)分污染區(qū)及清潔區(qū)醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第19頁相關標準GB15979-一次性使用衛(wèi)生用具衛(wèi)生標準GB15980-1995一次性使用醫(yī)療用具衛(wèi)生標準GB15981-1995消毒與滅菌效果評價方法和標準醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第20頁三、滅菌控制

微生物試驗使用試劑、器材等常需用濕熱滅菌法。濕熱滅菌溫度和時間需驗證，必須確保物品滅菌后無菌確保值SAL≤10-6。滅菌程序經驗證合格后方可使用。定時進行BD試驗、真空泄漏測試、溫度參數(shù)測試（空載熱分布、定載熱穿透、滿載熱穿透）、壓力改變速率測試（GB8599-大型蒸汽滅菌器技術要求），同時以生物指示劑驗證滅菌效果,必須確保物品滅菌后無菌確保值SAL小于百萬分之一。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第21頁三、滅菌控制

全部器具應采取可靠方法滅菌置壓力蒸汽滅菌器內121℃30min或置電熱干燥箱內180℃2h。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第22頁濕熱滅菌控制相關標準GB18281.3-醫(yī)療保健產品滅菌生物指示物第3部分:濕熱滅菌用生物指示物ISO11138-3-醫(yī)療保健產品滅菌.生物指示物.第3部分:濕熱滅菌用生物指示劑醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第23頁四、培養(yǎng)基管理1、培養(yǎng)基制備2、培養(yǎng)基貯藏3、培養(yǎng)基質量控制試驗醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第24頁四、培養(yǎng)基管理靈敏度檢驗（中國藥典）無菌檢驗（ISO11737.2:或GBT19973.2-）醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第25頁五、無菌操作定義：是指在執(zhí)行試驗過程中，預防一切微生物侵入機體和保持無菌物品及無菌區(qū)域不被污染操作技術和管理方法。無菌操作技術是微生物試驗基本技術，是確保微生物試驗準確和順利完成主要步驟。無菌操作技術主要包含兩方面：創(chuàng)造無菌培養(yǎng)環(huán)境及在操作和培養(yǎng)過程中預防一切其它微生物侵入。創(chuàng)造無菌培養(yǎng)環(huán)境包含提供密閉培養(yǎng)容器、培養(yǎng)容器滅菌、培養(yǎng)基滅菌等；預防一切其它微生物侵入辦法包含紫外線殺菌、甲醛熏蒸、超凈臺消毒與檢測、操作工具、器皿滅菌、操作方法等。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第26頁微生物試驗前準備微生物試驗控制1：人員管理微生物試驗控制2：環(huán)境控制微生物試驗控制3：滅菌控制微生物試驗控制4：培養(yǎng)基管理微生物試驗控制5：無菌操作醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第27頁微生物基本操作

瓊脂平板接種法瓊脂斜面接種法半固體接種法肉湯培養(yǎng)基接種法醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第28頁瓊脂平板接種法細菌在自然界及人體中分布廣，種類多，為了了解菌譜，須先將各種細菌分離，取得純菌培養(yǎng)物后才能深入作細菌判定。瓊脂平板培養(yǎng)基因面積大，接種后可到達分離目標，常稱分離培養(yǎng)法。平板接種方法有各種。以下介紹平行劃線法及分區(qū)劃線法。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第29頁瓊脂平板接種法（分離培養(yǎng)法）分區(qū)劃線法醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第30頁瓊脂平板接種法（分離培養(yǎng)法）平行劃線法醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第31頁瓊脂平板接種法（分離培養(yǎng)法）醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第32頁單個菌落醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第33頁單個菌落醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第34頁瓊脂斜面接種法目標：多用于純種細菌增菌和保留菌種方法：用滅菌接種環(huán)取細菌培養(yǎng)物少許。拔去瓊脂斜面培養(yǎng)基塞，管口經火焰上滅菌，將沾有細菌接種環(huán)伸入管內，自下而上在瓊脂上蜿蜒劃線；接種后，管口在火焰上滅菌，塞回塞，接種環(huán)滅菌：在試管口處做好標識，置37℃培養(yǎng)18－24小時醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第35頁大腸桿菌斜面金黃色葡萄球菌斜面醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第36頁肉湯接種法目標：用于增菌。方法：用滅菌接種環(huán)取細菌培養(yǎng)物少許；以無菌操作將沾有細菌接種環(huán)伸入肉湯中，將環(huán)上細菌輕輕研磨于靠近液面管壁上，然后將試管稍傾斜，使肉湯碰及細菌即可；接種后管口滅菌，塞回塞，接種環(huán)滅菌，并做好標識，置37℃培養(yǎng)18-24小時醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第37頁半固體接種法（穿刺接種法）目標：增菌和保留菌種；觀察細菌有沒有動力。方法：用接種針，將取有細菌接種針自培養(yǎng)基中央刺入（不要接觸管底），沿原穿刺線撥出，注意在刺入與拔出時不可晃動接種針；接種后做好標識。置37℃培養(yǎng)18-24小時．醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第38頁半固體瓊脂培養(yǎng)基（0.5%）

醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第39頁菌懸液制備（使用麥氏比濁管）麥氏比濁管：是McFarland創(chuàng)造一個用于微生物比濁不一樣濁度標準濁度管。詳細配制方法是依據硫酸和氯化鋇百分比來定，有表可查，這么不一樣百分比生成硫酸鋇沉淀濃度不一樣，且都有定值。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第40頁麥氏比濁管配比管號(McFarland)0.5123450.25%BaCl2（ml）0.20.40.81.21.62.01%H2SO4(ml)9.89.69.28.88.48.0細菌近似濃度(×108/ml)13691215醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第41頁菌懸液制備（使用麥氏比濁管）【材料】1、試驗所需微生物新鮮培養(yǎng)物如：金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物；2、無菌生理鹽水、麥氏比濁管；3、酒精燈、接種環(huán)、無菌吸管、平皿。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第42頁菌懸液制備（使用麥氏比濁管）【方法】1、輕搖標準試管；2、無菌操作挑取金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物至無菌生理鹽水試管（與標準管相同直徑）中混勻，直到濁度與所要求標準管濃度相同；3、序列稀釋已挑取菌落生理鹽水試管至所需菌液濃度如：100cfu/ml;4、用平皿計數(shù)法驗證所配置菌液實際濃度。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第43頁菌懸液制備（使用麥氏比濁管）【使用技巧】1、直接用眼睛看（需要經驗，誤差較大）。2、找張白紙打上平行直線，利用光在不一樣濃度液體折射不一樣幫助觀察比較。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第44頁123456786×1086×1076×1066×1056×1046×1036×1026×101麥氏1號管稀釋梯度表（cfu/ml）醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第45頁菌懸液制備（使用分光光度儀）分光光度儀

醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第46頁菌懸液制備保留菌懸液制備：菌懸液制備后應在2小時內使用，若保留在2～8℃菌懸液能夠在24小時內使用。黑曲霉也可制成穩(wěn)定孢子懸液保留在2～8℃，在驗證過貯存期內替換對應量新鮮孢子懸液使用。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第47頁培養(yǎng)基質量控制：靈敏度檢驗

靈敏度檢驗所需六種菌：金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]ATCC6538銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]ATCC9027枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]ATCC6633生孢梭菌[CMCC(B)64941]ATCC11437白色念珠菌[CMCC(F)98001]ATCC10231黑曲霉[CMCC(F)98003]ATCC16404依據培養(yǎng)基功效選擇靈敏度試驗所需菌種醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第48頁中國藥典年版明確要求：培養(yǎng)基靈敏度、微生物程度檢驗法檢驗所用菌株傳代次數(shù)不得超出5代（從菌種保留中心取得冷凍干燥菌種為第0代），并采取適宜菌種保藏技術，以確保試驗菌株生物學特征。培養(yǎng)基質量控制：靈敏度檢驗醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第49頁中國藥典年版在新增“藥品微生物試驗室規(guī)范指導標準”中對菌種有了較為明確要求：允許使用標準菌株和商業(yè)派生菌株標準菌株應按保藏機構提供說明進行復活標準貯備菌株應進行純度和特征確認標準貯備菌株提議采取低溫冷凍干燥、液氮貯存或超低溫冷凍保藏方法標準貯備菌株可用于制備每個月或每七天一次轉種工作菌株冷凍菌株解凍后不得重新冷凍和再次使用工作菌株不可替換標準菌株，商業(yè)派生菌株僅可用作工作菌株培養(yǎng)基質量控制：靈敏度檢驗醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第50頁菌株傳代基本概念標準菌株：由國內或國際菌種保藏機構保藏，遺傳學特征得到確認和確保并可追溯菌株。（0代）標準貯備菌株：由標準菌株經一次傳代得到培養(yǎng)物。（1代）商業(yè)派生菌株：由供給商提供全部特征與標準菌株等效菌株。（2代）工作菌株：由標準貯備菌株經傳代得到培養(yǎng)物。（2代）代：將活微生物接種到新鮮培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并希望獲取新微生物培養(yǎng)物。這種操作方式，新培養(yǎng)物對接種培養(yǎng)物而言就稱為一代。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第51頁采購第2代超低溫冷凍標準貯備菌種工作菌種第3代工作菌種第3代工作菌種第4代工作菌種第4代工作菌液第5代工作菌液第5代工作菌液第5代工作菌液第5代制備工作菌種進行菌種保藏模式圖醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第52頁各類菌種保藏條件及時間

菌種培養(yǎng)基保留溫度傳種時間細菌普通多用于營養(yǎng)瓊脂或依據菌種要求選取培養(yǎng)基4~6℃芽孢桿菌3~6個月，其它細菌每個月酵母菌普通用麥芽汁瓊脂或麥芽汁酵母膏瓊脂4~6℃普通4~6個月絲狀真菌普通用PDA瓊脂、蔡氏瓊脂或麥芽汁瓊脂等4~6℃每4個月移植一次（每2個月移植一次）醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第53頁

菌種保管

?菌種保管應有專員負責，保留與加鎖冰箱中或特制白鐵箱中加鎖置陰暗處，確保菌種安全。因工作變動時，必須做好交接工作。?菌種應有詳細登記本，包含名稱、分離日期、判定日期、判定者、主要判定性能，并注意統(tǒng)計使用、轉移及銷毀情況和原因。?各種菌種應按要求時間定時移種。普通每移種3次后作一次全方面判定。注意菌種有沒有污染和變異，如發(fā)覺污染和變異時，應及時更換。?購置菌種，應有介紹信。全部保留菌種應具備清單，并定時向部門責任人匯報。

醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第54頁FTM靈敏度檢查培養(yǎng)基標準菌種(10-100cfu/ml)30～35℃培養(yǎng)培養(yǎng)天數(shù)12345FTM(12ml)金黃色葡萄球菌管1管2緑膿桿菌管3管4枯草芽孢桿菌管5管6生胞梭菌管7管8空白對照管9醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第55頁培養(yǎng)基質量控制：靈敏度檢驗接種金黃色葡萄球菌、緑膿桿菌、枯草芽孢桿菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h；用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml菌液備用。接種生胞梭菌新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h；用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml菌液備用。接種白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48h；用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml菌液備用。接種黑曲霉新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)5～7d,加3～5ml0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液至無菌試管內，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml孢子懸液備用。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第56頁菌種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉；制備成活菌數(shù)＜100cfu菌懸液備用菌株傳代次數(shù)不得超出5代培養(yǎng)基接種每種菌接種至2管對應培養(yǎng)基，另取一支不接種作空白對照，按要求溫度時間培養(yǎng)。結果判斷空白對照管應無菌生長，每種菌接種后2管培養(yǎng)基管均生長良好，該培養(yǎng)基靈敏度檢驗符合要求。培養(yǎng)條件金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌接種至營養(yǎng)肉湯（或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）30～35℃培養(yǎng)18～二十四小時；生孢梭菌接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中30～35℃培養(yǎng)3天；白色念珠菌、黑曲霉接種至改良馬丁培養(yǎng)基中23～28℃培養(yǎng)5天培養(yǎng)基質量控制：靈敏度檢驗醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第57頁培養(yǎng)基質量控制：無菌檢驗每批滅菌培養(yǎng)基隨機取不少于5支(瓶)，培養(yǎng)14天，應無菌生長。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第58頁無菌試驗醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第59頁無菌試驗預防假陽性辦法1在一個專門準備、環(huán)境控制房間內層流罩環(huán)境中進行測試2在整個測試過程中使用無菌技術3用防止污染方法把測試器皿、培養(yǎng)基和測試物品引入測試區(qū)4測試產品表面細菌污染，在引導測試物品進入測試區(qū)之前，先對產品外包裝進行消毒。5對測試中使用設備、材料和產品進行滅菌6簡化進行測試必須操作7盡可能防止懸浮微粒產生8環(huán)境時時監(jiān)測（沉降菌檢測）醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第60頁無菌試驗相關標準GBT19973.2--醫(yī)用器材滅菌微生物學方法第二部分：確認滅菌過程無菌試驗ISO11737-2-醫(yī)用器材滅菌微生物學方法第二部分：確認滅菌過程無菌試驗醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第61頁無菌試驗：培養(yǎng)條件不論哪種無菌試驗方法：FTM32.5±2.5℃，不少于14天；SCDB22.5±2.5℃，不少于14天；改良馬丁23-28℃，不少于14天。假如14以內觀察到陽性結果，無須繼續(xù)培養(yǎng)。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第62頁無菌試驗陽性對照應依據供試品特征選擇陽性對照菌：無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主供試品．以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性菌為主供試品以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗霉菌供試品，以白色念珠菌為對照菌。加菌量小于l00cfu，供試品用量同供試品無菌試驗時每份培養(yǎng)基接種樣品量。陽性對照管培養(yǎng)48～72小時應生長良好．醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第63頁陰性對照陰性對照：陰性對照供試品無菌試驗時，應取對應溶劑和稀釋同法操作作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第64頁無菌試驗：結果判斷肉湯培養(yǎng)基有菌生長常見三種形式：混濁生長：液體變混濁。菌膜：液體澄清，表面有一薄層菌膜。沉淀生長：液體澄清，管底有沉淀物醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第65頁混濁生長：液體變混濁醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第66頁肉湯培養(yǎng)基有菌生長常見形式醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第67頁無菌試驗：結果判斷1.陽性對照管應生長良好，陰性對照管應無菌生長2.培養(yǎng)期間逐日觀察并統(tǒng)計是否有菌生長，如培養(yǎng)14天后，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，但不能確定是否有微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉種至同種新鮮培養(yǎng)基或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上，細菌培養(yǎng)兩天，霉菌培養(yǎng)三天，觀察接種同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁或斜面是否有菌生長；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第68頁釋出物檢驗

醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第69頁無菌試驗驗證：釋出物檢驗目標：對未知或可疑供試品，在進行無菌試驗試驗前進行方法驗證試驗，以確認供試品在該試驗條件下無抑菌活性或其抑菌活性能夠忽略不計。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第70頁無菌試驗驗證：釋出物檢驗取滅菌產品以無菌操作轉移到培養(yǎng)基中,30-35℃培養(yǎng)24hrs；

注意：使用與實際無菌試驗同種等量培養(yǎng)基接種每毫升濃度小于100cfu菌種稀釋液在無菌培養(yǎng)基內，一式兩份，其中一份加入無菌試樣，另一份作為陽性對照，并在適當溫度培養(yǎng)不超出5天。按表1所列菌種重復以上步驟。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第71頁無菌樣品100cfu菌種＋無菌樣品試驗組對照組釋出物檢查在適當溫度培養(yǎng)不超出5天。選擇適當微生物，重復以上步驟。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第72頁釋出物檢驗解釋：經過與陽性對照對比，假如在培養(yǎng)容器內看不到微生物生長，則說明使用樣品能抑止細菌或霉菌生長。能夠考慮使用無菌中和劑，如吐溫80、卵磷脂、偶氮植物凝血素、β-內酰胺酶。假如中和劑無效，增加培養(yǎng)基量。盡可能使用能使試驗微生物生長最小培養(yǎng)基量。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第73頁大豆酪蛋白消化物培養(yǎng)基(SCDM)菌種培養(yǎng)溫度培養(yǎng)條件培養(yǎng)時間枯草芽孢桿菌ATCC663322.5±2.5o需氧3天白色念珠菌ATCC1023122.5±2.5o需氧3-5天釋出物檢驗慣用菌種醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第74頁初始污染菌醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第75頁定義生物負載：一件產品和/或包裝上存活微生物總數(shù)。生物負載預計值：經過對活菌計數(shù)或滅菌前活菌計數(shù)加上一個回收效率賠償系數(shù)，得出組成生物負載微生物數(shù)值。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第76頁初始污染菌相關標準GBT19973.1--醫(yī)用器材滅菌微生物學方法第一部分產品上微生物總數(shù)預計ISO-11737-1:GBT19973.1--醫(yī)用器材滅菌微生物學方法第一部分產品上微生物總數(shù)預計醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第77頁樣品份額取樣標準

1定義：樣品份額(SIP)sampleitemportion，即從某一保健產品單元上取出用于試驗部分。2取樣注意事項2.1若可操作，試驗應使用整個產品單元。但這往往被認為是不可行，產品單元上樣品份額宜在試驗室易于操作前提下盡可能大。2.2假如所用樣品份額((SIP)小于一個完整產品單元，則應選擇代表產品單元含有微生物部分。假如已驗證微生物在產品單元上是均勻分布，應從產品單元上任一部位選擇樣品份額。在缺乏這些驗證情況下，應從產品單元上隨機選擇幾個部分作為樣品份額。2.3樣品份額本身應對產品單元內產品有代表性。當產品分成不一樣部分，能夠分裝于兩個或多個容器內。樣品份額能夠依據供試產品單元長度、質量、體積或表面積。假如產品單元有標簽說明只是液路無菌，宜把液路視為整個試驗單位。(即SIP=1)2.4SIP選擇舉例，見表1醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第78頁表1SIP選擇舉例選擇SIP依據標準樣品表面積放植物(非吸收)質量粉狀、手術衣/單、植入物(可吸收)長度管路(直徑不變)管路(直徑不變)體積水、液體液路靜脈輸注器，液袋醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第79頁表1SIP選擇舉例選擇SIP依據標準樣品表面積放植物(非吸收)質量粉狀、手術衣/單、植入物(可吸收)長度管路(直徑不變)管路(直徑不變)體積水、液體液路靜脈輸注器，液袋醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第80頁校正因子醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第81頁校正因子定義：用于對活菌計數(shù)或滅菌前活菌計數(shù)進行修正數(shù)值，以賠償產品上無法完全洗脫微生物，方便計算出生物負載預計值。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第82頁校正因子重復洗脫方法試驗步驟1取樣品1件或sip，投入一定量無菌洗脫液中(A)。2樣品處理采取旋渦混臺器(2800次／min)，振蕩2min。3注皿：取處理洗脫液A2ml，分別注入兩個無菌平皿中，每平皿1ml。4再洗脫:將樣品從洗脫液A中取出瀝干，移入另一定量無菌洗脫液中(B)。5再處理:將B洗脫液置旋渦混臺器(2800次／min)振蕩2min。6再注皿:取B洗脫液2ml，分別注入兩個無菌平皿內，每平皿lml。注：當微生物數(shù)少時,從B洗脫液開始，即可用無菌濾膜過濾后直接放培養(yǎng)基中培養(yǎng)。7如此重復洗脫4次．即A、B、C和D，直至洗脫累積量(初始污染菌)不再增加，最終瀝干樣品，將其平鋪于無菌平皿中(E)。然后將熔化并冷至45～48℃NA培養(yǎng)基，分別注入A～E各平皿每皿15ml。8待凝固后，放置在要求培養(yǎng)條件下(30～35℃，48h～82h)培養(yǎng)，進行活菌計數(shù)。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第83頁校正因子=1/0.3825=2.61

編號平皿均數(shù)×稀釋倍數(shù)瓊脂覆蓋總數(shù)回收率％洗脫1洗脫2洗脫3洗脫4平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均180010003001008220836.23260080020005160537.3837006002002002170241.13平均38.25校正因子計算醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第84頁校正因子計算同批產品，需抽取3-5件，進行重復性試驗，確定最小、最大及平均回收率和初始污染菌數(shù)。依據校正因子，滅菌前初始污染計數(shù)乘以校正因子即為產品帶菌總數(shù)。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第85頁初始污染菌方法驗證檢驗洗脫液有沒有抑菌作用檢驗樣品有沒有抑菌作用醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第86頁無菌洗脫液＋初始污染菌樣品＋100cfu菌種1.試驗組3.樣品對照組初始污染菌方法驗證（藥典）在3次獨立平行試驗中:洗脫液對照組(4)菌回收率應均不低于70%。（4/2）×100％試驗組(1)菌回收率應均不低于70%（1-3）/2×100％2.菌液組4.洗脫液對照組100cfu/ml菌種無菌洗脫液＋初始污染菌樣品無菌洗脫液＋100cfu菌種醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第87頁初始污染菌方法驗證（ISO11737）選取滅菌產品，假如洗脫技術中用到洗脫液，每一產品都應經受常規(guī)微生物洗脫技術，則將一定數(shù)量易受破壞微生物放人洗脫液中，回收微生物。選取滅菌產品，假如產品直接放人培養(yǎng)基中，能夠參考無菌試驗抑菌試驗進行。醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第88頁滅菌產品＋100cfu菌種常規(guī)洗脫回收細菌數(shù)100cfu/ml菌種1試驗組2對照組試驗組回收細菌數(shù)/對照組菌數(shù)×100％≥70％初始污染菌方法驗證（ISO11737）醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第89頁微生物試驗試驗前試驗中試驗后環(huán)境控制培養(yǎng)基質量滅菌控制人員控制無菌操作方法驗證靈敏度試驗無菌檢驗無菌試驗初始污染菌B/F驗證洗脫液驗證樣品無抑菌作用儀器校正沉降菌檢測簡化操作醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第90頁物體表面細菌總數(shù)

醫(yī)療器械檢化員微生物培訓專家講座第91頁物體表面細菌總數(shù)方法：將內徑為5cm×5cm滅菌規(guī)格板，放在被檢物件體表面，依據物體表面積大小，采平行樣l