流式細胞術(shù)簡介專家講座

流式細胞術(shù)介紹ForFCMTraining流式細胞術(shù)簡介第1頁流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)（FlowCytometry,簡稱FCM）是一個能夠快速、準(zhǔn)確、客觀，而且同時檢測單個微粒（通常是細胞）多項特征技術(shù)，同時能夠?qū)μ囟ㄈ后w加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細胞、染色體、微生物、及人工合成微球等研究微粒特征包含各種物理及生物學(xué)特征，并加以定量流式細胞術(shù)簡介第2頁流式細胞儀系統(tǒng)介紹經(jīng)過流式細胞儀我們能夠得到以下信息

- 相對細胞大小

-相對細胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度

-染色過細胞相對熒光強度流式細胞術(shù)簡介第3頁InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流式細胞術(shù)簡介第4頁流式細胞儀光信號散射光信號熒光信號流式細胞術(shù)簡介第5頁1.散射光信號前向角散射光（FSC,ForwardScatter）入射激光同向散射光信號細胞相對大小及其表面積。側(cè)向角散射（SSC,SideScatter）

入射激光90角散射光信號

細胞粒度及細胞內(nèi)相對復(fù)雜性。流式細胞術(shù)簡介第6頁前向角散射光——FSCForwardAngleLightScatterFALSSensorLaser流式細胞術(shù)簡介第7頁側(cè)向角散射光——SSCFALSSensor90LSSensorLaser流式細胞術(shù)簡介第8頁散射光散射光能被用來區(qū)分不一樣細胞群體基本形態(tài)上差異

- 通常使用“散點圖”來看散射光信號

- 散點圖上一個點就代表一個細胞顆粒數(shù)據(jù)流式細胞術(shù)簡介第9頁散點圖——DotPlotlysedwholeblood流式細胞術(shù)簡介第10頁ReviewQuestionDeadcellsareknowntobesmallerandtoexhibitmoreinternalcomplexitythanlivecells.Whichofthepopulationsonthisplotwouldyouexpecttobedead?AB流式細胞術(shù)簡介第11頁2.熒光信號熒光素吸收激光能量熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換為 振動能和熱能 釋放較入射光波長更長光量子熒光素與特異抗體結(jié)合熒光抗體與細胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生熒光信號越強 流式細胞術(shù)簡介第12頁熒光檢測器FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)流式細胞術(shù)簡介第13頁Two-ColorCellAnalysisWhichofthethreepopulationshasthemostAbAbindingsites?AbAAbB流式細胞術(shù)簡介第14頁當(dāng)代流式細胞儀包含液流系統(tǒng)聚焦細胞以供檢測光學(xué)系統(tǒng)激發(fā)和搜集光信號電子系統(tǒng)將光信號轉(zhuǎn)化為電信號，并使其數(shù)字化以供計算機分析

流式細胞術(shù)簡介第15頁液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)將樣本懸液聚焦在光源中心處流式細胞術(shù)簡介第16頁SampleFlowinOpticalCuvetteSampleLaminar

FlowLowSampleFlowRate12mL/minSheathSheathSampleLaminar

FlowSheathSheathOpticalCuvetteHighSampleFlowRate60mL/min流式細胞術(shù)簡介第17頁ReviewQuestionWhichofthefollowingwouldcausedisturbanceinthelaminarflowoftheopticalcuvette?bubblescellularconcentrationsampleflowrate流式細胞術(shù)簡介第18頁Optics

Excitationopticsconsistof:LasersLensesandmirrorsthatroutethelaserlighttothefluidicstreamCollectionopticsconsistof: Filtersthatdirectthesignalstotheappropriateopticaldetectors流式細胞術(shù)簡介第19頁OpticalFilters460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50

Longpass Shortpass Bandpass流式細胞術(shù)簡介第20頁FACSCalibur光路圖流式細胞術(shù)簡介第21頁OpticsLaserFluorochromesDetectorParameterFilterFITCGFPFL1530/30PEPIFL2585/42PerCPPerCP-CY5.5FL3670LPAPCFL4661/16488nm635nm流式細胞術(shù)簡介第22頁ElectronicsConvertsanalogsignalstoproportionaldigitalsignalsComputesHeight

foreachpulseCalculateswidthandareaInterfaceswiththecomputerfordatatransfer流式細胞術(shù)簡介第23頁CreationofaVoltagePulse-AnalogSignalLaserLaserLaserTimeVoltageTimeVoltageTimeVoltage流式細胞術(shù)簡介第24頁QuantificationofaVoltagePulseTime

VoltsPulseAreaPulseHeightPulseWidth0Heightisameasurementforallparameters.Width=Area/Height流式細胞術(shù)簡介第25頁EffectoftheInstrumentControlsontheDataInstrumentControlsDetectorFSCdetector250gainFSCdetector350gain流式細胞術(shù)簡介第26頁Review

DataProcessingFL2FL1SSCFSCFL4FL3流式細胞術(shù)簡介第27頁ReviewQuestionsWhichofthefollowingfluorochromescannotbeusedwiththeFACSCalibur?DAPI(ex.345nm,emits455nm)PropidiumIodide(ex.536nm,emits617nm)AlexaFluor647(ex.650nm,emits668nm)WhatarethethreemeasurementsofaparticlethatcanbedeterminedbyFACSCalibur?Brieflydescribethefunctionsofthefluidics,optics,andelectronicssystems.流式細胞術(shù)簡介第28頁ReviewQuestionsWhatwouldhappentothepopulationbelowifyouincreasedtheRedparametervalueintheInstrumentcontrols?流式細胞術(shù)簡介第29頁ReviewQuestionsWhichinstrumentcomponentsensurethatthefluorescencesignalofaspecificfluorochromeisonlymeasuredbyadesignateddetector?Forexample,APCisonlymeasuredbytheFL4detector.流式細胞術(shù)簡介第30頁樣本處理流式細胞術(shù)簡介第31頁細胞懸液制備細胞懸液：分離PBMC、PRP等：操作復(fù)雜，分離、離心步驟造成細胞特定群體丟失，并可能引入一些誤差直接使用外周血、骨髓：最靠近生理情況，操作簡便，樣本用血量小灌洗液、體腔積液培養(yǎng)細胞、細胞系實體組織：病理組織：新鮮樣本/石蠟包埋樣本針吸組織：新鮮樣本鞘液、洗液等：清潔無顆粒雜質(zhì)流式細胞術(shù)簡介第32頁步驟一：

選擇適當(dāng)熒光染料必須能夠被流式細胞儀上所配置激光器所激發(fā)激發(fā)光譜必須在儀器上濾光片能夠接收適當(dāng)范圍內(nèi)熒光素光譜重合應(yīng)該盡可能降低流式細胞術(shù)簡介第33頁熒光產(chǎn)生過程流式細胞術(shù)簡介第34頁PropidiumIodide400nm500nm600nm700nmPIDNAExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nm流式細胞術(shù)簡介第35頁Fluorescein(FITC)400nm500nm600nm700nmWavelengthProteinExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nm流式細胞術(shù)簡介第36頁ExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmPhycoerytherin(PE)Protein流式細胞術(shù)簡介第37頁Allophycocyanin(APC)Protein632.5nm(HeNe)ExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nm流式細胞術(shù)簡介第38頁

FITC和PE熒光光譜

流式細胞術(shù)簡介第39頁賠償調(diào)整前后對比FL1FL2流式細胞術(shù)簡介第40頁步驟二：

染色體積溫度孵育時間對照流式細胞術(shù)簡介第41頁直接染色FluorescentprobeattachedtoantibodySpecificsignal:weakNonspecificbinding:low流式細胞術(shù)簡介第42頁間接染色Fluorescentprobeattachedtoa2ndantibodySpecificsignal:strong,5-62ndAb/each1stAb;Nonspecificbinding:high流式細胞術(shù)簡介第43頁Avidin-BiotinmethodIbiotinylatedprimaryAbbiotinavidinbiotinylateddye流式細胞術(shù)簡介第44頁步驟三：

數(shù)據(jù)搜集和分析畫圖尋找目標(biāo)細胞調(diào)整儀器設(shè)置到適當(dāng)狀態(tài)我們能夠得到怎樣結(jié)果？它們意味著什么？流式細胞術(shù)簡介第45頁儀器設(shè)置調(diào)整1.用未染色細胞調(diào)整儀器PMT電壓2.用單染色細胞調(diào)整儀器賠償流式細胞術(shù)簡介第46頁關(guān)于同型對照例：一個雙色染色試驗抗體AFITC，抗體BPE

對應(yīng)同型對照是IgG1FITC,IgG1PE那么需要準(zhǔn)備是陰性對照：細胞加上IgG1FITC,IgG1PE單陽性對照：

FITC:細胞加上AbAFITC,IgG1PEPE:細胞加上AbBPE,IgG1FITC流式細胞術(shù)簡介第47頁數(shù)據(jù)分析設(shè)門設(shè)定陰性與陽性群體界限確定陽性與陰性細胞群體統(tǒng)計陽性或陰性細胞群體百分率，平均熒光值，絕對數(shù)或抗體結(jié)合數(shù)流式細胞術(shù)簡介第48頁怎樣設(shè)定陰性與陽性界限流式細胞術(shù)簡介第49頁流式細胞術(shù)簡介第50頁流式細胞術(shù)簡介第51頁細胞結(jié)構(gòu)細胞大小細胞粒度細胞表面面積核漿百分比DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量染色體分析細胞功效細胞表面/胞漿/核特異性抗原細胞活性細胞內(nèi)細胞因子酶活性激素結(jié)合位點細胞受體細胞凋亡在上述信號基礎(chǔ)上細胞分選流式細胞術(shù)細胞學(xué)應(yīng)用流式細胞術(shù)簡介第52頁流式細胞儀臨床應(yīng)用HIV免疫分型，CD4絕對計數(shù)白血病和淋巴瘤免疫分型腫瘤細胞周期和倍體分析網(wǎng)織紅細胞計數(shù)細胞移植交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測干細胞計數(shù)殘量白血病細胞檢驗HLA-B27檢驗血小板功效及相關(guān)疾病流式細胞術(shù)簡介第53頁流式細胞儀科研應(yīng)用免疫功效研究癌癥病人多藥耐藥性細胞動力學(xué)功效研究動物性別篩選海洋與環(huán)境微生物分析染色體分選流式細胞術(shù)簡介第54頁流式細胞儀遺傳學(xué)應(yīng)用細胞DNA,RNA含量測定染色體倍體分析染色體分離基因表示產(chǎn)物生物活性研究基因轉(zhuǎn)染表示生物效應(yīng)基因表示調(diào)控研究細胞內(nèi)基因定位酵母轉(zhuǎn)基因株篩選匯報基因定性定量檢測植物遺傳學(xué)研究??????流式細胞術(shù)簡介第55頁WhatcanFlowCytometertellusaboutacell?CellLineage/SubsetPhenotypeCytokine/ChemokineProductionRepertoireCytokine/ChemokineReceptorRepertoireMigration/HomingPhenotypreCellcyclestatus流式細胞術(shù)簡介第56頁細胞增殖（細胞周期）細胞內(nèi)DNA含量增殖相關(guān)基因表示BrdU結(jié)合示蹤染料流式細胞術(shù)簡介第57頁DNA探針DNA探針最主要特點是，它們與DNA含量是成化學(xué)正比關(guān)系——這么，帶有探針熒光分子數(shù)目就和DNA分子含量相當(dāng)，從而檢測DNA含量流式細胞術(shù)簡介第58頁NucleicacidProbes菲啶基PropidiumIodideEthidiumBromide苯甲亞胺Hoechst33342抗生素Mithramycin,ChromamycinA3AcridineOrange-AOPyronynY流式細胞術(shù)簡介第59頁G2MG0G1s0

200

400

600

8001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle

流式細胞術(shù)簡介第60頁AtypicalDNAHistogramG0-G1SG2-MFluorescenceIntensity#ofEvents流式細胞術(shù)簡介第61頁紅色為正常二倍體細胞；黃色為異倍體細胞流式細胞術(shù)簡介第62頁

增殖相關(guān)基因PCNA(Proliferatingcellnuclearantigen)

一個蛋白質(zhì)，在DNA復(fù)制和核苷酸切除修復(fù)中起到作用Ki-67-proliferationrelatedantigenKi-S1-proliferationrelatedantigenPhospho-histoneCyclinD1,E,A,B1流式細胞術(shù)簡介第63頁

BrdUrdIncorporationBromodeoxyuridine(BrdU)是一個胸腺核苷類似物能夠在細胞增殖和細胞周期狀態(tài)分析中起作用BrdU能與正在復(fù)制周期內(nèi)細胞相結(jié)合使用BrdU抗體能夠檢測到BrdU流式細胞術(shù)簡介第64頁

BrdUrdIncorporation流式細胞術(shù)簡介第65頁

細胞分裂分析

哺乳動物免疫系統(tǒng)需要有大量增殖，能夠確?？乖禺愋訲細胞和B細胞含有足夠增殖速度，能夠?qū)Ω吨尾∩镌斐筛腥綜FSE是一個示蹤染料，能夠均等地在兩個子代細胞中分布，其結(jié)果能夠區(qū)分出8-10代子細胞。流式細胞術(shù)簡介第66頁TracingDye(CFSE)流式細胞術(shù)簡介第67頁

Apoptotic

CellDeath

--ageneticallyencodedcelldeathprogram,whichismorphologically,biochemicallyandmolecularlydistinctfromnecrosis流式細胞術(shù)簡介第68頁Flowcytometryofapoptoticcelldeath細胞散射光在細胞調(diào)亡中，細胞收縮，從而FSC下降，SSC上升或是沒有顯著改變流式細胞術(shù)簡介第69頁流式細胞術(shù)簡介第70頁Flowcytometryofapoptoticcelldeath熒光吸收細胞胞膜對于DNA染料通透性和細胞活性、死亡和凋亡相關(guān)，像PI、EB、Hoechst-33342等，能夠用來區(qū)分活細胞、死細胞和凋亡細胞流式細胞術(shù)簡介第71頁FlowcytometryofapoptoticcelldeathFCMofCaspases經(jīng)過抗體和活化caspase-3片斷相結(jié)合來檢測

使用特異性caspase-3熒光底物新抗原決定基CK18流式細胞術(shù)簡介第72頁流式細胞術(shù)簡介第73頁Flowcytometryofapoptoticcelldeath線粒體功效改變

TMP會在調(diào)亡中產(chǎn)生，能夠經(jīng)過一些標(biāo)識用流式細胞儀檢測。使用有膜穿透性親脂性陽離子熒光染料，如Rh123,DiOC6,JC-1,CMXRos等，可作為流式檢測探針。

當(dāng)細胞發(fā)生調(diào)亡時，一個線粒體膜表面蛋白——7A6抗原會出現(xiàn)Bcl-2/baxfamilyofproteins.

流式細胞術(shù)簡介第74頁流式細胞術(shù)簡介第75頁流式細胞術(shù)簡介第76頁Flowcytometryofapoptoticcelldeath鈣離子流和pH值改變

胞漿內(nèi)Ca2+水平上升和因為細胞內(nèi)環(huán)境酸化造成選擇性pH值調(diào)整降低是伴伴隨細胞凋亡產(chǎn)生后果之一。使用Ca2+選擇性熒光探針，如Quin-2,Fluo-3,Indo-1經(jīng)過流式檢測是測定細胞內(nèi)Ca2+濃度最正確方案酸化檢測一樣能夠用對pH敏感熒光探針，如DCH,BCECF,BCECF-AM,SNAFLs,SNARFs等進行檢測流式細胞術(shù)簡介第77頁FlowcytometryofapoptoticcelldeathPhospholipidredistribution流式細胞術(shù)簡介第78頁流式細胞術(shù)簡介第79頁FlowcytometryofapoptoticcelldeathDNA鏈斷裂細胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶（一些Caspase底物）在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長度在180-200bpDNA片段。斷裂末端能夠經(jīng)過末端轉(zhuǎn)脫氧核苷酰酶(TdT)連接上dUTP。流式細胞術(shù)簡介第80頁流式細胞術(shù)簡介第81頁流式細胞術(shù)簡介第82頁流式細胞術(shù)簡介第83頁Flowcytometryofapoptoticcelldeath細胞DNA含量

在凋亡細胞中，用PI染色，經(jīng)過流式檢測DNA含量，能夠發(fā)覺一個亞群細胞，其染色熒光強度下降。這是因為伴隨調(diào)亡進行，核酸內(nèi)切酶活化，隨即一部分DNA泄漏出去，造成細胞內(nèi)DNA含量下降造成。流式細胞術(shù)簡介第84頁FlowCytometryofApoptoticCellsPI-Fluorescence#EventsApoptoticcellsNormalG0/G1cells流式細胞術(shù)簡介第85頁

AnIntegratedApproach

toCellImmunology流式細胞術(shù)簡介第86頁ImmuneFunctionassay

免疫細胞亞群檢測Antigen-peptidespecificTcells檢測T-cells活化TregCells細胞內(nèi)細胞因子/趨化因子檢測磷酸化流式細胞術(shù)簡介第87頁淋巴細胞亞群分析依據(jù)功效，淋巴細胞主要分為B淋巴細胞（CD19+），與體液免疫相關(guān)T淋巴細胞（CD3+），與細胞免疫相關(guān)總T和總B能夠用來判斷一些免疫缺點和本身免疫性疾病

NK細胞（CD3-CD16+56+），行使免疫監(jiān)控功效，

能夠介導(dǎo)對一些腫瘤細胞和病毒感染細胞細胞毒性作用。流式細胞術(shù)簡介第88頁淋巴細胞亞群分析依據(jù)CD4、CD8表示，T淋巴細胞又分為T輔助/誘導(dǎo)細胞（CD3+CD4+）T抑制/細胞毒性細胞（CD3+CD8+）Th/Ts評價那些本身免疫失調(diào)或被懷疑是免疫失調(diào)或已知患有免疫缺點病人免疫狀態(tài)，另外，這一比值還可用來監(jiān)測骨髓移植病人以免受到急性GVHD攻擊

Th/Ts升高：本身免疫性疾?。愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、SLE）Th/Ts降低：病毒感染、惡性腫瘤、再生障礙性貧血流式細胞術(shù)簡介第89頁AbsoluteCounts--CellspermLPositiveCellAbsoluteCountBeadsNegativeCellCD4PECD4PE流式細胞術(shù)簡介第90頁抗原特異性T細胞提供檢測者一個強有力工具用于研究對病毒抗原免疫應(yīng)答和疫苗開發(fā)流式細胞術(shù)簡介第91頁MHC:ClassIandClassIIGeneProductsTcell受體不直接和可溶性抗原相連抗原必須經(jīng)過MHC由抗原呈遞細胞傳遞給T細胞(Macrophages,Dendriticcells,Bcells)MHCClassIGeneProducts呈遞抗原給CD8+Tcells誘導(dǎo)細胞毒應(yīng)答MHCClassIIGeneProducts呈遞抗原給CD4+Tcells誘導(dǎo)細胞因子產(chǎn)生，免疫球蛋白分泌流式細胞術(shù)簡介第92頁

MHC/TCRSignaling流式細胞術(shù)簡介第93頁二聚體可溶性MHC類似物與四聚體比較流式細胞術(shù)簡介第94頁Quantitationofantigen-specificTlymphocytesinperipheralblood

HAMControlHIVCD8Tax-A2/IgGag-A2/Ig流式細胞術(shù)簡介第95頁Treg細胞檢測Treg細胞與本身免疫耐受相關(guān)，通常檢測方法用CD4陽性細胞中CD25高表示，同時結(jié)合胞內(nèi)FoxP3含量來判斷最新發(fā)覺人Treg細胞低表示CD127。CD127表示模式與Foxp3很靠近，說明低表示CD127，高/中表示CD25CD4陽性T淋巴細胞就是Treg細胞（調(diào)整性T細胞）。該方法比胞內(nèi)檢測Foxp3優(yōu)點在于，檢測后細胞可用于后續(xù)培養(yǎng)及其它體外試驗。另外優(yōu)點是用這種檢測方案分選Treg細胞得率更高。流式細胞術(shù)簡介第96頁流式細胞術(shù)簡介第97頁ImmuneFunctionAssays--APowerfulResearchToolforAnsweringBasicBiologicalQuestionsin...AIDS或癌癥機理研究Tcell亞群對于病毒和細菌抗原反應(yīng)細胞介導(dǎo)對機會感染免疫反應(yīng)藥品/疫苗效果評價

免疫調(diào)整移植監(jiān)控毒理研究流式細胞術(shù)簡介第98頁流式細胞術(shù)簡介第99頁流式細胞術(shù)簡介第100頁流式細胞術(shù)簡介第101頁TraditionalCytokineFlowCytometryIL-2PhycoerythrinCD4FITC流式細胞術(shù)簡介第102頁細胞因子檢測細胞因子是可溶性蛋白，在淋巴細胞免疫功效調(diào)整方面發(fā)揮主要作用。細胞因子能夠調(diào)整各種細胞生長、分化和功效，調(diào)整正常與病理狀態(tài)下免疫應(yīng)答，碩士理或病理免疫調(diào)整原因所致細胞因子合成應(yīng)答與改變是研究疾病病因與免疫狀態(tài)主要工具。流式細胞術(shù)簡介第103頁T細胞細胞因子分型Ⅰ型細胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)引發(fā)遲發(fā)過敏反應(yīng)、巨噬細胞活化、2型反應(yīng)下調(diào)刺激起源：病毒、一些細菌Ⅱ型體液介導(dǎo)免疫反應(yīng)引發(fā)B細胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、1型反應(yīng)下調(diào)刺激起源：多細胞寄生蟲、過敏源流式細胞術(shù)簡介第104頁細胞因子流式細胞術(shù)簡介第105頁BiologicalVariationAmongCMV-seropositiveDonorsinResponsetoCMV流式細胞術(shù)簡介第106頁CFC&Proliferation 使用溫和方法進行細胞破膜和固定，在中性pH值條件下，使細胞和BrdU結(jié)合，能夠同時檢測到：S期細胞周期

表型活化狀態(tài)核型決定基胞漿內(nèi)決定基細胞因子/趨化因子其它…………..流式細胞術(shù)簡介第107頁CFC&ProliferationAllowsthecorrelationof:PhenotypeCytokineexpressionCellCycleProliferation流式細胞術(shù)簡介第108頁BDPhosflow磷酸化檢測系統(tǒng)更加好特異性抗體建立在單個細胞基礎(chǔ)上檢測能夠同時檢測多個參數(shù)快速、靈敏、樣本量更少流式細胞術(shù)簡介第109頁PPYYYY非磷酸化特異性抗體 ?檢測全部相關(guān)蛋白 unphosphorylated+phosphorylated亞型 ?抗原：重組蛋白質(zhì)片斷磷酸化特異性抗體

?僅僅檢測磷酸化亞型 ?抗原：合成4-10mer磷酸化肽段Y磷酸化特異性和非磷酸化特異性抗體差異流式細胞術(shù)簡介第110頁BDPhosFLOW和Westernblot比較AtheoreticalexperimentcomparingWesternblotandflowcytometrywiththreesamplesandaproteinofinterestat1,10,or50copiespercell.Sample2and3lookthesameviaWesternblot,butwhenstainedwithfluorescentlylabeledantibodies,thedifferencesbetweenthesamplesbecomemorerelevant.(Source:P.O.Krutziketal./ClinicalImmunology110()206–221)流式細胞術(shù)簡介第111頁BDPhosFlowGenomics&Proteomics--SingleCellsHaveBigProteomicsStoryto

Tell.

BDPhosFlownotonlytellsyouactivationofasinglecellforoneparticularphosphoproteinandpathway,butallowsyoutostudymultiplephosphorylationeventsandpathwayssimultaniously.流式細胞術(shù)簡介第112頁100101102103104100101102103104PBMC050100150200250FSC-H050100150200250SSC-HCD20PerCP-Cy5.5CD3PEZap70(Y319)/Syk(Y352)Alexa647

100101102103104020406080100100101102103104020406080100100101102103104020406080100100101102103104100101102103104CD3PE100101102103104020406080100100101102103104020406080100100101102103104020406080100CD3-/CD20+

CD3+/CD20-CD3-/CD20-CD20PerCP-Cy5.5WholeBloodCD3CrossLink

050100150200250FSC-H050100150200250SSC-H21.8Multi-ColorPhosFlowinCD3/CD28orCD3crosslinkedhumanPBMCsorWholeBloodCD3/CD28CrosslinkUntreatedcells(unshaded)vstreatedcells(shaded)流式細胞術(shù)簡介第113頁BDCBA

一個“三明治”免疫測定法——

使用結(jié)合有高親和性抗體小球，用來特異性地捕捉可溶性抗原.

用熒光檢測抗體來檢測被捕捉抗原

使用流式細胞儀進行檢測分析流式細胞術(shù)簡介第114頁流式細胞術(shù)簡介第115頁MultiplexedBeadsShadesofacolorAntibodycoupledbeads,emittingatdistinctFL3intensitiesVariousanalytesAntibodycoupledPElabel,emittingatFL2intensityproportionaltoanalyteconc.流式細胞術(shù)簡介第116頁MultiplexedBeads0pg/mL80pg/mL1250pg/mL5000pg/mLFL3BeadsFL2(PE)流式細胞術(shù)簡介第117頁使用BD?CytometricBeadArray

(CBA)系統(tǒng)你能夠:

?從單一小體積樣本中得到多項檢測結(jié)果?對全部檢測項目，只需要制備一個標(biāo)準(zhǔn)混合物來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?防止人為造成酶聯(lián)放大假陽性信號產(chǎn)生?用更少時間和精力，卻得到大量結(jié)果?假如是用488nm和635nm兩根激光器來試驗，試驗條件更輕易建立?使用配有HTS選件BD流式細胞儀能夠做到自動平板上樣和高通量檢測流式細胞術(shù)簡介第118頁當(dāng)前CBA主要提供檢測內(nèi)容可溶性細胞因子細胞凋亡相關(guān)蛋白磷酸化蛋白流式細胞術(shù)簡介第119頁BDCBAFlexSetABCDEFGHI123456789FL4-HorRed-AFL3-HorNIR-AOldFormatBDCBABeadsBDCBAFlexSetBeads流式細胞術(shù)簡介第120頁更為靈活強大CBAFlexSet最多可同時檢測72個項目可自由選擇搭配檢測項目檢測項目范圍更廣泛需要488nm和635nm兩種波長激光器ABCDEFGHI123456789FL4-HorRed-AFL3-HorNIR-A流式細胞術(shù)簡介第121頁9個指標(biāo)同時檢測活化T細胞1234567891.Itk(Y511)2.ERK(T202/Y204)3.JNK(T183/Y185)4.P38(T180/Y182)5.PLCg(Y783)6.ZAP70(Y319)7.LAT(Y171)8.c-Jun(S63)9.RSK(S380)流式細胞術(shù)簡介第122頁KineticsofJurkatCellActivationWithAnti-CD3/CD28110100FOLDINCREASEINUNITS/ML05101520TIME(MINUTES)RSK(S380)Jun(S63)LAT(Y171)Itk(Y511)ZAP-70(Y319)PLCg