中國藥典菌種的傳代與保藏

版《中國藥典》菌種傳代與保藏

廣東藥檢

陳睿

年8月中國藥典菌種的傳代與保藏第1頁

菌種是從事微生物學及生命科學研究基本材料，在醫(yī)學領域中，診療制品制備，菌苗生產(chǎn)、微生物致病性研究，藥品抑菌試驗及藥品微生物檢驗等都有一套完整菌種.微生物含有生命活力，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡，所以菌種保藏是一項主要基礎工作，是微生物學基礎工作一項主要內(nèi)容，也是藥品微生物工作中一項慣用技術。一、菌種保藏意義中國藥典菌種的傳代與保藏第2頁

如藥品中控制菌檢驗使用陽性對照菌須預防因?qū)掖蝹鞔龟栃詫φ站?jīng)典生物學特征發(fā)生改變及菌株死亡，確保到達菌種長久正確形態(tài)；

如藥品微生物學檢驗過程中，檢出可疑致病菌須妥善保藏，以到達深入判定目標，確保用藥安全。

中國藥典菌種的傳代與保藏第3頁二、菌種代號意義

國內(nèi)藥品微生物檢驗所用菌種代號是CMCC（F）或CMCC（B）CMCC——中國醫(yī)學菌種保藏中心B——代表細菌，F(xiàn)——代表真菌。大腸桿菌[CMCC(B)44102]乙型副傷寒沙門桿菌[CMCC(B)50094]銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]生孢梭菌[CMCC(B)64941]白色念珠菌[CMCC(F)98001]中國藥典菌種的傳代與保藏第4頁

三、慣用菌種保藏方法

(一)菌種保藏原理依據(jù)微生物菌種生理、生化特征，在人工創(chuàng)造條件下盡可能降低微生物細胞代謝強度，使細胞基本處于休眠狀態(tài)，生長繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減低菌種變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物代謝作用。低溫、干燥、真空是用于菌種保藏主要伎倆。

中國藥典菌種的傳代與保藏第5頁

選擇保藏方法時，首先應考慮方法能否長久地保持菌種原有特征，同時也應兼顧到方法經(jīng)濟和簡便。在實際工作中，往往各種條件同時使用,以提升保藏效果。（二）菌種保藏步驟①挑選特征經(jīng)典純菌菌落；②確定保藏適當菌體形態(tài)；③選擇最適宜保藏方法；④定時對保藏菌種進行檢驗，觀察是否發(fā)生改變，若有改變，須改變保藏方法。保藏期滿應及時進行移種。中國藥典菌種的傳代與保藏第6頁1.瓊脂斜面低溫保留法

（1）方法：將經(jīng)常使用菌種經(jīng)典菌落接種在斜面（一些特殊菌種可用液體培養(yǎng)基）上，按要求溫度和時間培養(yǎng)，待充分生長后，把培養(yǎng)好新鮮菌種用牛皮紙保好，為減緩培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，延長保藏時間，可將菌種保藏管棉花塞換成橡膠塞。放在4℃左右冰箱中保藏。每隔2~3個月移種一次，繼續(xù)進行保藏。若用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，普通可保藏六個月~一年。有甚至更長時間。

（2）適用范圍：細菌、酵母菌、霉菌保藏。中國藥典菌種的傳代與保藏第7頁大腸桿菌斜面金黃色葡萄球菌斜面中國藥典菌種的傳代與保藏第8頁

生孢梭菌白色念珠菌

需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基真菌培養(yǎng)基中國藥典菌種的傳代與保藏第9頁各類菌種保藏條件及時間

菌種培養(yǎng)基保留溫度傳種時間細菌普通多用于營養(yǎng)瓊脂或依據(jù)菌種要求選取培養(yǎng)基4~6℃芽孢桿菌3~6個月，其它細菌每個月酵母菌普通用麥芽汁瓊脂或麥芽汁酵母膏瓊脂4~6℃普通4~6個月絲狀真菌普通用PDA瓊脂、蔡氏瓊脂或麥芽汁瓊脂等4~6℃每4個月移植一次（每2個月移植一次）中國藥典菌種的傳代與保藏第10頁（3）特點：優(yōu)點是——簡便，易于推廣；普通不需要另選擇保藏用培養(yǎng)基；對大多數(shù)微生物都適用。缺點是——保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。中國藥典菌種的傳代與保藏第11頁（4）注意事項：保藏菌種應是生命活力旺盛新鮮培養(yǎng)物，最少應是第三代培養(yǎng)物。保藏時，破傷風桿菌可用庖肉培養(yǎng)基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。必須定時檢驗保藏菌種冰箱溫度、濕度以及菌種管棉塞是否松動或生霉，如有異常應及時處理。每次移植后，應與原菌種編號、名稱逐一查對，確證培養(yǎng)基特征和純度無誤后再繼續(xù)保藏。保藏菌種培養(yǎng)基應無糖，其它菌類含糖小于2%為宜，以免產(chǎn)酸過多，影響菌種存活。

銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，不宜用本法保留。

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2、液體石蠟保留法：

本法是用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種生理生化水平，并可預防水分蒸發(fā)，從而延長菌種保藏期。

（1）方法：

將菌種接種于斜面或穿刺于0.3~0.5%瓊脂半固體高層培養(yǎng)基中，培養(yǎng)好備用。取化學純液體石蠟裝在試管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上紙，121℃高壓滅菌30min，取出置37℃溫箱或110~170℃烤箱中1~2h或干燥器內(nèi)除去液體石蠟中水分。中國藥典菌種的傳代與保藏第13頁將上述液體石蠟加入培養(yǎng)好菌種試管內(nèi)，液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基最上端1㎝為宜，將試管直立，放入4℃冰箱中保藏。適用范圍：適合用于保藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對細菌保藏效果較差。

中國藥典菌種的傳代與保藏第14頁

液體石蠟對各類菌種保藏效果

菌種菌株數(shù)保留時間（年）存活率（%）細菌霉菌酵母菌放線菌87586400380552420.983.688.991.3中國藥典菌種的傳代與保藏第15頁（3）特點：本方法簡便易行，是試驗室慣用一個保藏方法，該法主要使菌種與空氣隔絕。（4）注意事項：①保藏時，用新鮮培養(yǎng)物接種，應檢驗純度和特征后，方可進行保藏。②保藏過程中，需經(jīng)常觀察斜面是否干燥，如干燥，需重新移種。③使用菌種時，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊，再用接種針挑取培養(yǎng)物接種到新鮮斜面上培養(yǎng)，待長出新培養(yǎng)物后，再移種一次到新斜面上即可使用。中國藥典菌種的傳代與保藏第16頁④將沾有少許液體石蠟接種針浸于95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免直接在酒精燈下燒灼時，液體石蠟四濺，引發(fā)污染。⑤液體石蠟在菌種管中高出培養(yǎng)基高度要嚴格控制，如太多，會影響菌種交換氣體，使保藏效果不好；如太少，斜面輕易干燥，將縮短保藏期。普通以高出斜面1㎝為宜。

⑥制備無菌液體石蠟時，每管裝量不能太多，不然分裝到菌種培養(yǎng)基中易造成污染。中國藥典菌種的傳代與保藏第17頁3、半固體瓊脂培養(yǎng)基（0.5%）4、40%甘油保留法：

中國藥典菌種的傳代與保藏第18頁四、試驗用菌種培養(yǎng)傳代方法

程序：

凍干菌復蘇————接種（斜面）（菌種傳代）（營養(yǎng)肉湯）制備菌懸液對照菌液檢定用標準菌種，由中國藥品生物檢定所提供，為冷凍干燥菌種。菌種復蘇與保留在專用無菌室或超凈工作臺內(nèi)進行。中國藥典菌種的傳代與保藏第19頁

1菌種復蘇

?把凍干菌種管、滅菌1ml滴管、雙碟、鑷子、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面數(shù)支，移入接種室或凈化工作臺。?先用砂輪將凍干菌種安瓶頸部挫出刻痕,再將凍干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75%乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點燃酒精燈，將菌種管封口一端在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌滴管吸收營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，滴在灼熱菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。

中國藥典菌種的傳代與保藏第20頁

?取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂管口打開，放入滅菌雙碟內(nèi)，另取1支滅菌滴管，在火焰旁吸收營養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌攪動促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，分別接種至營養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯內(nèi)，并將滴管及菌種管投入消毒液內(nèi)，將已接種營養(yǎng)肉湯及營養(yǎng)瓊脂斜面置35~37℃培養(yǎng)22~24h。?

取出培養(yǎng)物，仔細觀察菌苔形態(tài)、有沒有雜菌、涂片、革蘭氏染色鏡檢，呈經(jīng)典菌落后，轉(zhuǎn)種3代即可應用。如發(fā)覺菌型不經(jīng)典，可進行平板分離單菌落。

中國藥典菌種的傳代與保藏第21頁

2菌種傳代與保留

方法（1）：菌斜面菌斜面（保留）?培養(yǎng)基應新鮮制備，如斜面已無冷凝水者，不宜再使用。標簽上著名菌名及接種日期。至冰箱取出菌種斜面，應在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺。?點燃酒精燈，用左手握住菌種斜面，將管口靠進火焰旁，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅30秒，隨即將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返經(jīng)過3次。左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手用無名指、小指及掌部夾住棉塞，撥開棉塞，將接種環(huán)伸人管內(nèi)先在近壁瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮去少許菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰旁。中國藥典菌種的傳代與保藏第22頁?堵上棉塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面1支，照上述操作打開棉塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面低部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面表面波折移動，使細菌劃在斜面表面上。?取出接種棒，在火焰旁將培養(yǎng)基管棉塞堵上，然后將接種過細菌接種棒在火焰上燒灼滅菌。?將已接種畢細菌管置35~37℃培養(yǎng)22~24小時，霉菌管普通置20~25℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7日。取出后放人冰箱保留，普通3個月轉(zhuǎn)種一次。中國藥典菌種的傳代與保藏第23頁

方法2：菌斜面營養(yǎng)肉湯分離平板菌斜面假如菌落形態(tài)不經(jīng)典可純化，按以下方法傳代（分離菌落）：用接種環(huán)取上述菌管（斜面）菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(5ml/支,已滅菌),置35~37℃培養(yǎng)18~24小時后，再用接種環(huán)取培養(yǎng)好營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液），接種于分離平板，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時，用接種針選經(jīng)典菌落劃線于營養(yǎng)瓊脂斜面，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時。普通同時接種幾支管，其中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培養(yǎng)基中，其它用做工作菌種。中國藥典菌種的傳代與保藏第24頁慣用分離平板：大腸埃希菌——EMB瓊脂平板中國藥典菌種的傳代與保藏第25頁銅綠假單胞菌——

溴化十六烷三甲銨瓊脂培養(yǎng)基中國藥典菌種的傳代與保藏第26頁金黃色葡萄球菌——甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基中國藥典菌種的傳代與保藏第27頁沙門菌——SS瓊脂平板

中國藥典菌種的傳代與保藏第28頁

3菌懸液制備

取上述培養(yǎng)好菌種斜面移入接種室或凈化工作臺，放置室溫后,用接種環(huán)取菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(5ml/支,已滅菌),將已接種畢細菌管置35~37℃培養(yǎng)18~24小時，取出備用。普通于冰箱中保留可用7天。中國藥典菌種的傳代與保藏第29頁

4對照用菌液制備

取上述培養(yǎng)好營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液）1ml，加到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-1，再取另一只吸管吸收10-1菌液1ml加到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-2……以這類推，稀釋至含活菌數(shù)在50~100個。用平板計數(shù)。此稀釋菌液用于試驗后加陽性對照，可在1天內(nèi)使用。中國藥典菌種的傳代與保藏第30頁菌種菌種

工作菌種培養(yǎng)基菌懸液對照菌液大腸桿菌營養(yǎng)瓊脂斜面營養(yǎng)肉湯0.9%氯化鈉溶液沙門菌營養(yǎng)瓊脂斜面營養(yǎng)肉湯0.9%氯化鈉溶液金黃色葡萄球菌營養(yǎng)瓊脂斜面營養(yǎng)肉湯0.9%氯化鈉溶液銅綠假單胞菌營養(yǎng)瓊脂斜面營養(yǎng)肉湯0.9%氯化鈉溶液生孢梭菌硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基0.9%氯化鈉溶液白色念珠菌真菌瓊脂斜面真菌培養(yǎng)基0.9%氯化鈉溶液中國藥典菌種的傳代與保藏第31頁

五、菌種保管

?菌種