色譜柱使用及維護

色譜柱使用及維護第1頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六實驗室常用色譜柱：C8柱、C18柱、氰基柱、苯基柱、氨基柱、手性柱、離子交換柱不同色譜柱的選擇依據(jù)色譜柱的結(jié)構(gòu)良好的色譜柱使用習(xí)慣及維護建立方法時應(yīng)注意的事項色譜柱失效的特征指示第2頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六色譜柱類型分離原理備注常規(guī)RP柱相似相容常規(guī)NP柱相似相容離子交換色譜柱溶質(zhì)離子與樹脂交換中心離子相互作用強度的差異流動相的pH、離子強度手性色譜柱引入手性環(huán)境使對映異構(gòu)體間呈現(xiàn)物理特征的差異一般以疏水作用和空間作用為主第3頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六一般色譜柱選擇的依據(jù)：以反相色譜為例：當(dāng)被兩種以上的分析物的疏水性存在較大差異時，選擇一般的C8/C18即可；當(dāng)被分析物疏水性相差無幾，但氫鍵作用相差較大時，可選用氰基柱、氨基柱；苯基柱對含有不同芳環(huán)的芳香化合物具有較好的分離能力；對離子性化合物，可采用離子交換柱或者離子對反相色譜柱第4頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六不銹鋼柱管：可用于所有的有機溶劑與大多數(shù)水性緩沖液，然而含氯的流動相會緩慢地“鹵素腐蝕”不銹鋼柱管，尤其是低pH條件下柱管不銹鋼成分（鐵、鎳、鉻）牢固絡(luò)合的樣品可能發(fā)生這類問題，但因為色譜柱內(nèi)壁的表面積很小，發(fā)生不良反應(yīng)的機會不大色譜柱的結(jié)構(gòu)第5頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六多孔燒結(jié)物（濾片）：封閉色譜柱的兩端，固體色譜柱的填料一般來說，5um與3um的微粒分別用2um與0.5um孔徑的不銹鋼濾片發(fā)生不良反應(yīng)的可能比色譜柱內(nèi)壁大得多峰型不好與樣品回收率低可能預(yù)示濾片出現(xiàn)問題第6頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六壓帽：即色譜柱兩端套合于柱管端外壁的塑性圓柱帽，中部有小孔，多為聚四氟乙烯制成，用于固定篩板密封環(huán)：位于接頭螺旋環(huán)內(nèi)壁的彈性環(huán)，多為聚四氟乙烯制成，用于色譜柱兩端壓帽與柱外壁的密封柱填料：色譜柱擔(dān)體，常用的填料為硅膠、多孔聚合物、氧化鋁等第7頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六優(yōu)點優(yōu)良的物理特性可控的成熟工藝?yán)硐氲谋砻婊钚詢?yōu)良的溶劑兼容性（不存在不溶脹）硅膠填料的特性第8頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六缺點在高pH條件下，硅膠溶解第9頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六第10頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六良好的色譜柱使用習(xí)慣第11頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六使用前的準(zhǔn)備工作閱讀使用說明書（特別注意使用事項、pH范圍、保存條件）→按要求活化色譜柱→測定柱效，記錄色譜柱參數(shù)信息→流動相平衡色譜柱進樣建議：建立色譜柱信息臺賬（項目所屬的色譜柱的柱壓、拖尾因子、分離度、進樣時間），定期對色譜柱進行柱效的測定建議：色譜柱項目專用----頻換的更換流動相很容易降低色譜柱的壽命，并容易造成試驗保留值的漂移第12頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六第13頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六

第14頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六實例第15頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六第16頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六第17頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六第18頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六第19頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六日常維護：每次分析結(jié)束后色譜柱的清洗反沖不同廠家不一致：月旭----正向使用，反向沖洗Agilent----優(yōu)先正向，最后反沖Phenomenex----反沖迪馬-----反沖第20頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六特殊維護----色譜柱出現(xiàn)異常的維護第21頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六第22頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六柱壓高---建議：a)將水通道與緩沖鹽定期進行清洗；b)密封墊與轉(zhuǎn)子磨損造成的微粒是堵塞色譜柱濾片的主要來源，定期更換泵密封墊與進樣閥轉(zhuǎn)子一般能減少濾片的堵塞；c)在開發(fā)分析方法時注意緩沖鹽與有機相的互溶性，尤其是在梯度洗脫;d)接保護柱第23頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六固定相流失的原因：硅膠基質(zhì)的流失---高水、高溫、高pH鍵合相的流失----低pH、高水建議：流動相pH、水相限制在色譜柱的使用范圍內(nèi)第24頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六強保留物質(zhì)的積累：導(dǎo)致色譜峰拖尾，展寬建議的解決方法：不同廠家色譜柱不一致。詳見各廠家建議的色譜柱沖洗程序。第25頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六前延峰拖尾峰裂縫或分叉峰胖頭峰或饅頭峰保留時間波動較大常見的色譜峰異常問題及解決方案

第26頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六前延峰第27頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六第28頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六可能原因：a)填料丟失，多見于酸性物質(zhì)，換柱b)溶劑效應(yīng)，采用流動相溶解樣品解決方法：換柱采用流動相溶解增加緩沖鹽的濃度，抑制次保留效應(yīng)提高柱溫，加快傳質(zhì)速率第29頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六拖尾峰第30頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六可能原因：樣品過載次保留效應(yīng)，尤其是堿性物質(zhì)填料中殘留的痕量金屬離子流動相試劑中的金屬離子不合適的緩沖鹽溶液第31頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六解決方案：降低進樣量加入掃尾劑（酸---1%乙酸；堿----10mmol/ml三乙胺，三乙胺無效，可改為EDTA）盡量采用色譜級試劑增加緩沖鹽的濃度第32頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六產(chǎn)生次保留效應(yīng)的因素--離子交換效應(yīng)離子交換效應(yīng)：質(zhì)子化的堿性分子與離子化的硅羥基發(fā)生離子交換產(chǎn)生次級保留效應(yīng)第33頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六產(chǎn)生次保留效應(yīng)的因素—痕量金屬離子金屬離子所產(chǎn)生的強吸附位比硅羥基強50倍?。「滓饓A性物質(zhì)的拖尾第34頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六嚴(yán)重拖尾-----強保留組分第35頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六嚴(yán)重拖尾峰的出現(xiàn)往往是強保留污染物在柱頭進口處聚集的信號?。。〉?6頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六峰分叉第37頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六可能原因：柱填料坍塌柱過載色譜柱中存在“空穴”（使用中避免撞擊）第38頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六解決方案：更換色譜柱降低進樣量第39頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六寬峰或饅頭峰第40頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六可能原因：色譜柱方面：1、柱填料坍塌；2、色譜柱或保護柱被污染；3、過載流動相方面：流速過低、緩沖鹽濃度、流動相比例柱外效應(yīng)：樣品池過大、色譜柱與檢測器的鏈接管路較長、記錄儀相應(yīng)時間不對第41頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六保留時間波動較大的可能原因：不同批號色譜柱（柱填料的硅羥基相互作用、比表面積、碳含量差異較大所致）色譜柱失效強烈建議：任何情況下，在規(guī)定的色譜柱上建立的方法，都應(yīng)該用至少兩個其他批次柱進行證實后，才可采用?。?！不同廠家的同種色譜柱很少得到相同的分離！（迪馬、菲羅門、安捷倫）第42頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六實驗室中常見的不良習(xí)慣：一個項目使用不同廠家型號的色譜柱進行有關(guān)物質(zhì)檢測色譜柱的頻換的更換各種流動相流速直接從0ml/min變?yōu)?.0ml/min（安捷倫1260自帶緩慢升流速裝置）猛烈撞擊色譜柱色譜柱兩端的螺母未擰緊使用緩沖鹽不過渡極性相差較大的流動相直接互換第43頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六保護柱不影響分離效果填料選擇不當(dāng)會引起時間的漂移安裝不正確，死體積增大，峰形變差色譜柱的使用誤區(qū)

第44頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六第45頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六載碳量越高反相色譜柱就越好保留能力取決于物質(zhì)的疏水性大小容易發(fā)生相塌陷保留時間重現(xiàn)性較差色譜柱的使用誤區(qū)第46頁，共49頁，2023年，2月20日，星期六新柱柱壓越低，色譜柱越好粒徑均一，壓降相對越低壓力與流動相的黏度、粒徑大小有關(guān)色譜柱的壓力不應(yīng)超過公式計算所得的30%色譜柱的使用誤區(qū)第47頁，共49頁，2023年，2月2