分子生物學(xué)第三章-DNA結(jié)構(gòu)課件

Chapter3DNA’sstructureAntiparallel反向平行strandsofthedoublehelixareorganizedinoppositeorientation,sothatthe5′endofonestrandisalignedwiththe3′endoftheotherstrand.

Basepairing堿基配對describesthespecific(complementary)interactionsofadenine腺嘌呤withthymine胸腺嘧啶orofcytosine胞嘧啶withguanine鳥嘌呤inaDNAdoublehelix(theformerisreplacedbyadeninewithuracil尿嘧啶indoublehelicalRNA).

Complementary互補basepairs堿基對aredefinedbythepairingreactionsindoublehelicalnucleicacids(AwithTinDNAorwithUinRNA,andCwithG).

Supercoiling超螺旋describesthecoilingofaclosedduplexDNAinspacesothatitcrossesoveritsownaxis.DNAisadoublehelix雙螺旋3.1DNA的一級結(jié)構(gòu)定義：核苷酸排列順序，或稱堿基排列順序。5’-ATCGGCTAAGGCTCCGACGA--3’3’-TAGCCGATTCCGAGGCTGCT--5’人類基因組計劃――20世紀生物學(xué)最宏偉計劃：人類基因組的作圖與測序。人類基因組計劃（1990-2005）；計劃耗資30億美元。人類基因組有30億堿基對的測序。核苷nucleotide糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵核苷酸nucleotide核苷酸是核苷的磷酸酯。作為DNA或RNA結(jié)構(gòu)單元的核苷酸分別是5′-磷酸-脫氧核糖核苷和5′-磷酸-核糖核苷。

由脫氧核糖和磷酸構(gòu)成DNA主鏈（或骨架），其結(jié)構(gòu)單元（由脫氧核糖和磷酸構(gòu)成）是彼此相同的。對各種DNA一級結(jié)構(gòu)而言，相互間的差別主要是在于所含的堿基的組成、數(shù)量及排列順序上。因此，在描述DNA的一級結(jié)構(gòu)時，總是以其所含堿基的序列為準，并用堿基的第一個英文字母構(gòu)成的字符串來表示。

Thedoublehelixmaintainsaconstantwidthbecausepurines嘌呤alwaysfacepyrimidines嘧啶inthecomplementaryA-TandG-Cbasepairs.ThesequenceinthefigureisT-A,C-G,A-T,G-C.

DNA的一級結(jié)構(gòu)涉及脫氧核糖核苷酸的種類、數(shù)量、排列位置和鍵連接關(guān)系DNA分子在一級結(jié)構(gòu)層次上是由許多脫氧核苷酸分子連接而成的多聚脫氧核苷酸長鏈分子，通常將鏈短者稱為脫氧寡核苷酸（deoxyoligonucleotide）在DNA分子中，脫氧核苷酸之間是通過磷酸二酯鍵連接起來的。多數(shù)DNA是線型分子，也有少數(shù)是環(huán)形分子。當線型多聚脫氧核糖核苷酸鏈的3’端羥基與其5’端的磷酸殘基縮合成酯后（即形成磷酸二酯鍵二連接起來），成為環(huán)形的DNA。快速而精確的測定合分析核酸的一級結(jié)構(gòu)，是核酸研究的一項關(guān)鍵技術(shù)。目前應(yīng)用的2種DNA序列測定技術(shù)是Sanger等提出的酶法（Sangermethod）合Maxam和Gilbert提出的化學(xué)降解法（Maxam－Gilbertmethod）Maxam－GilbertDNA化學(xué)降解法

該方法的基本步驟為(1)先將DNA的末端之一進行標記(通常為放射性同位素32P）(2)在多組互相獨立的化學(xué)反應(yīng)中分別進行特定堿基的化學(xué)修飾(3)在修飾堿基位置化學(xué)法斷開DNA鏈(4)聚丙烯酰胺凝膠電泳將DNA鏈按長短分開(5)根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶，直接讀出DNA的核苷酸序列。在這兩種方法中，利用化學(xué)降解法進行DNA測序具有較高的重現(xiàn)性，而且也容易為一般研究人員所掌握。它的明顯優(yōu)點是其所測定的序列是來自DNA分子而不是酶促合成反應(yīng)所產(chǎn)生的拷貝，因此，利用化學(xué)降解法可對合成寡核苷酸進行直接測序，可以分析注入甲基化等DNA修飾的情況。還可以通過化學(xué)保護及修飾干擾實驗來研究DNA二級結(jié)構(gòu)及DNA－蛋白質(zhì)相互作用。Sanger的酶法則需要有單鏈模板和特異的寡核苷酸引物，而且還需要高質(zhì)量的聚合物制劑。因其簡便快速，仍然被廣泛的應(yīng)用。DNA一級結(jié)構(gòu)是DNA結(jié)構(gòu)層次中的基礎(chǔ)層次，不僅是認識和研究二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，同時是進一步分析DNA結(jié)構(gòu)－功能關(guān)系的前提，而且有利于基因表達、調(diào)節(jié)和控制等多項分子生物學(xué)的研究。3.2DNA的二級結(jié)構(gòu)即雙螺旋結(jié)構(gòu)。受環(huán)境因素,如平衡離子類型、離子強度、特異結(jié)合蛋白、水合狀態(tài)等的影響,以及DNA分子堿基的組成都可促使DNA分子取不同的構(gòu)象。DNA分子存在多種構(gòu)象㈠B型結(jié)構(gòu):（右手雙螺旋）這是水溶液（或相對濕度92%以上）中的主要構(gòu)象。㈡A型結(jié)構(gòu)：相對濕度<75%，矮胖型，直徑大。㈢Z型結(jié)構(gòu)：Wang等人在研究人工合成的d(CGCGCG)單晶的X-射線衍射圖譜發(fā)現(xiàn)主鏈呈鋸齒排列。三個方面的發(fā)現(xiàn)1953年，基于三個方面的發(fā)現(xiàn)，Watson和Crick提出了雙螺旋模型：*X光衍射實驗數(shù)據(jù)表明DNA是一種規(guī)則螺旋結(jié)構(gòu)：每3.4nm旋轉(zhuǎn)一周，直徑約為2nm。因為相鄰核苷酸距離為0.34nm，因此每圈有10個核苷酸單位。*DNA密度測量說明這種螺旋結(jié)構(gòu)應(yīng)有兩條鏈。這樣如果兩條鏈間的堿基都是朝里而且嚴格的按嘌呤對嘧啶排列，螺旋直徑保持不變就很容易解釋，否則，嘌呤對嘌呤則太粗，嘧啶對嘧啶則太細。*不論堿基數(shù)目多少，G的含量總是與C一樣，而A與T也是一樣。因此通常以G+C的含量來描述DNA的組成。不同物種G+C的含量一般在26~74%。DNA中兩條核苷酸鏈是以堿基間的氫鍵相連的在通常狀況下，G只與C特異性的以氫鍵相接，而A則只與T相作用。這種反應(yīng)稱之為堿基互補反應(yīng)，而配對的堿基則被稱之為互補（A與T，G與C）在這種模型中，兩條核苷酸鏈是反向的（反平行），沿著螺旋旋轉(zhuǎn)方向，一條是5’-3’方向，而另一條是3’-5’方向。糖基-磷酸脂基構(gòu)成的主鏈暴露在外表面，并帶有磷酸脂基的負電荷。當DNA處于體外溶液時，電荷被一些能與之結(jié)合的金屬離子，一般是Na+，所中和；而在活體內(nèi)，則是由帶正電荷的蛋白質(zhì)提供中和電荷。這些蛋白質(zhì)在決定DNA的內(nèi)型上起著很重要的作用。堿基處于雙螺旋結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，平面結(jié)構(gòu)，垂直于螺旋軸成對排列。雙螺旋體類似于盤旋的樓梯：堿基對如同踏板，順著螺旋，堿基一個堆一個，像一疊盤子。Basepairsfillthecenterofthehelix;thephosphates()areontheoutside.TheB-formDNAhelixhasadiameterofabout20?~20?Abasepairismoreexposedtothesolventononeside(the“majorgroove”,atthetopintheseviews)thantheother(the“minorgroove”,bottom).B-formDNAconsistsofaright-handeddoublehelixwithantiparallelstrands34?(10bp)perturnmajorgrooveminorgroovemajorgrooveminor3.4?perbpThesedimensionsareforDNAfibers.Insolution,thereare~10.5base-pairsperturn.5’3’5’3’B-DNA:B-DNA的鈉鹽結(jié)構(gòu)是由兩條反向平行的多核苷酸鏈圍繞同一中心軸構(gòu)成的右手螺旋結(jié)構(gòu)。多核苷酸的方向由核苷酸間的磷酸二酯鍵的走向決定，一條從5’-3’，另一條從3’-5’。鏈間形成一條較淺的小溝和一條較深的大溝。兩條鏈上的堿基以氫鍵相連，G與C配對，A與T配對。雙螺旋的中心軸與堿基平面垂直，并穿過氫鍵的中點。相鄰堿基對平面間的距離為0.34nm，繞螺旋軸旋轉(zhuǎn)約36度。這樣約10個堿基對旋轉(zhuǎn)一周。堿基對層疊于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，磷酸與脫氫核糖在外側(cè)。脫氧核糖環(huán)平面與雙螺旋的中心軸大致平行。雙螺旋的直徑為2.0nmC-DNA是在特定的鹽和濕度（相對濕度44％-66％）條件下A型和B型之間的中間產(chǎn)物，屬于B族DNAD-DNA也是B族DNA的一員。天然DNA一般不采取D型雙螺旋結(jié)構(gòu)。但是當DNA中有A,T順序交替的富含AT區(qū)域，可能采取D型。Z-型DNA構(gòu)象的主要特征糖-磷酸主鏈的走向呈之字形,分子呈左手螺旋構(gòu)象，每一螺圈含12對堿基,距離為4.46nm。糖環(huán)折疊不同于A或B型DNA,鳥嘌呤堿基繞糖苷鍵旋轉(zhuǎn)呈順式構(gòu)型,而嘧啶堿基仍是反式構(gòu)型Z-DNA僅有一條小溝,且較深,含有較高的負電荷密度Z-DNA較B-DNA細而“舒展”,螺旋直徑為1.8nm。維系DNA二級結(jié)構(gòu)的主要作用力是氫鍵和堿基堆集力,而磷酸基的負電荷和堿基內(nèi)能則不利于雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定在生理狀況下,雙螺旋的堿基對之間氫鍵不斷地發(fā)生斷裂和再生,這就是DNA的所謂呼吸作用DNA在熱或其他變性劑作用之下,雙鏈發(fā)生分離,即變性作用。變性的DNA單鏈在適合的條件下又能恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu),即復(fù)性作用。基于DNA的變性作用和復(fù)性作用,產(chǎn)生了十分有用的分子雜交技術(shù)。DNA二級結(jié)構(gòu)的其他構(gòu)象反向重復(fù)序列:在同一多核苷酸鏈內(nèi)的相反方向上存在的重復(fù)的核苷酸序列。在雙鏈DNA中反向重復(fù)可能引起十字形結(jié)構(gòu)的形成。AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG281420281420富含G單鏈:可以形成多種穩(wěn)定的G4結(jié)構(gòu)DNA的四鏈結(jié)構(gòu)特征：①鳥嘌呤四聯(lián)體；②G-G首尾相接，異常氫鍵；③片層堆積，所有的方向一致。研究發(fā)現(xiàn)，各種端粒DNA都具有富含G鏈的簡單重復(fù)序列。DNA序列上的這種特殊性提示我們端?？赡苄枰@種特殊的序列以形成特殊的結(jié)構(gòu)大量的體外實驗表明，富含G單鏈可形成各種穩(wěn)定的G4結(jié)構(gòu)(G4structure)。四鏈DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及其影響因素一直是研究的熱點。體外實驗表明，四鏈結(jié)構(gòu)具有高熔解溫度，甚至可以達到100℃，，最初認為是在2層G4體之間螺旋軸附近插入了一個水分子并與堿基形成氫鍵而穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。在其后的研究中發(fā)現(xiàn)堿金屬離子對其形成與穩(wěn)定性有很大影響，特別是K+和Na+離子。三螺旋DNA存在條件：一條全嘌呤,另一條全嘧啶特征：①兩條全嘧啶鏈和一條全嘌呤鏈組成三螺旋結(jié)構(gòu)；②氫鍵為Hoogsten氫鍵；③第三條鏈位于正常雙螺旋的大溝中三鏈DNA既可以是B-DNA與另一條DNA鏈結(jié)合成的鏈間的三鏈DNA，又可以是B-DNA與其自身的一條鏈結(jié)合形成的鏈內(nèi)的三鏈DNA分子內(nèi)三鏈DNA于1987年由Mirkin在超螺旋中發(fā)現(xiàn)。其形成要求雙螺旋中存在連續(xù)的嘌呤或嘧啶序列，而且必須是鏡像重復(fù)序列鏡像重復(fù)序列：由反方向完全相同的兩個序列組成5′GGAATCGATCTTTTCTAGCTAAGG3′3′CCTTAGCTAGAAAAGATCGATTCC5′反轉(zhuǎn)重復(fù)（invertedrepeated)：由反方向互補的兩個DNA片段組成，兩個反轉(zhuǎn)重復(fù)序列又叫回文序列(palindromesequence)。鏡像重復(fù)(mirrorrepeat)：由反方向完全相同的兩個序列組成。直接重復(fù)(directrepeat)：由同一方向完全相同的兩個序列組成。正向重復(fù)序列、順向重復(fù)序列。3.3DNA的三級結(jié)構(gòu)——超螺旋（supercoil）生物體閉環(huán)DNA都以超螺旋形式存在，如細菌質(zhì)粒、病毒、線粒體DNA。線性DNA分子或環(huán)狀DNA分子中有一條鏈有缺口時不能形成超螺旋。超螺旋的意義：緊密，體積更小；能影響雙螺旋的解鏈程序，因而影響DNA分子與其它分子之間的相互作用。真核生物染色體三級結(jié)構(gòu)：生物界內(nèi)DNA都是負超螺旋，并由拓撲異構(gòu)酶產(chǎn)生拓撲異構(gòu)酶I

切開雙鏈DNA的一條鏈并將切口連接，不需要ATP水解供能，一般是使超螺旋變?yōu)樗沙谛?。E.Coli拓撲異構(gòu)酶I(ω蛋白)對單鏈DNA親和性較高,易識別負超螺旋。拓撲異構(gòu)酶I序列特異性很差；

拓撲異構(gòu)酶II

可同時切斷DNA的兩條鏈，需要ATP水解供能。分為兩個亞類，作用分別是引入負超螺旋和解開超螺旋。E.Coli的旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)可從松弛型DNA和正超螺旋中引入負超螺旋，需要ATP，當缺乏ATP時可松弛正、負超螺旋。超螺旋形成：首先斷開其中一條鏈然后將DNA鏈旋轉(zhuǎn)或扭轉(zhuǎn)連合缺口原核生物DNA超螺旋由拓撲異構(gòu)酶誘導(dǎo)形成，其首先斷開其中一條（酶I）或兩條（酶II）鏈然后將DNA鏈旋轉(zhuǎn)或扭轉(zhuǎn)再連合缺口，由ATP水解提供能量（一個ATP可用于形成一個超螺旋）。拓撲異構(gòu)酶亦解除超螺旋但不需能。真核生物中負超螺旋是由DNA與組蛋白結(jié)合形成核小體達到的，DNA以左手螺旋方向纏繞在核小體上。負超螺旋有利于DNA螺旋解旋暴露不配對的核苷酸以進行轉(zhuǎn)錄，復(fù)制及遺傳重組。同時負超螺旋利于B型轉(zhuǎn)化為Z-DNA，提高或抑制蛋白-DNA的結(jié)合，或參與原核生物基因的調(diào)控。3.4真核生物染色體一、染色體、染色質(zhì)染色體：真核生物的染色體都包含一個很長的線性DNA分子，并被組裝在細肥核內(nèi)，在細胞生活的大部分時間里以染色質(zhì)的形式存在。染色質(zhì)－由DNA和蛋白質(zhì)(組蛋白和非組蛋白)組成染色質(zhì)絲，是細胞核染色體主要存在形式；DNA與組蛋白形成核小體在纏繞形成螺線管，進一步折疊形成染色體；

常染色質(zhì)－折疊程度較低(1000~2000倍)，染色較淺;異染色質(zhì)－折疊程度較高(10000倍)，染色較深。分為組成型異染色質(zhì)和機動性異染色質(zhì)，組成型異染色質(zhì)從不轉(zhuǎn)錄(衛(wèi)星DNA)，機動性異染色質(zhì)可轉(zhuǎn)變?yōu)槌Ｈ旧|(zhì)可轉(zhuǎn)錄，如兩條X染色體的一條呈異染色質(zhì)化表現(xiàn)隨機失活。二、核小體1、發(fā)現(xiàn)：用微球菌核酸酶處理染色質(zhì)，會得到200bp的多個片段。核酸酶：外切E、內(nèi)切E2、核小體：是構(gòu)成真核生物染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，是DNA和Pr構(gòu)成的緊密結(jié)構(gòu)形式Olins夫婦（1974）和PierreChambon等（1975）在電鏡下觀察到染色質(zhì)的“繩珠”狀結(jié)構(gòu)，小球的直徑為100埃,Olins并把這種小球稱為小體。

H32-H42八聚體核心顆粒2×H2A-H2B染色質(zhì)小體(～166bp)核小體DNA166bp146bp(～200bp)H120bpDNA連接區(qū)(常為32～34bp)

核小體的組成

DNA與組蛋白組成核小體是染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，其將DNA裝配為穩(wěn)定螺旋形式參與基因調(diào)控如使得催化轉(zhuǎn)錄的酶暫時不能與DNA接觸。

組蛋白結(jié)構(gòu)特征：

1）進化上極端保守：核心組蛋白在物種間較保守，尤其在高等真核生物中。H3和H4最保守，其次H2A，H2B，H1變化最大。如哺乳動物間有20%差異，高等植物鍵則有75%差異。且H1物種內(nèi)甚至不同類型細胞間亦有不同變異體。H1的作用是與線形DNA結(jié)合以幫助后者形成高級結(jié)構(gòu)。生長和分裂過程產(chǎn)生的組蛋白變異體表明不同組蛋白的組合對正常生長分裂很重要。2）無組織特異性：僅發(fā)現(xiàn)鳥類、魚類及兩棲類紅細胞染色體不含H1而帶有H5。精細胞染色體的組蛋白是魚精蛋白是例外。

3）肽鏈上氨基酸分布的不對稱性：

組蛋白靠靜電吸引作用結(jié)合于染色質(zhì)可用酸或鹽提取，從所有真核生物中均可提取到五種組蛋白，即H1，H2A，H2B，H3和H4。組蛋白的堿性來自賴氨酸和精氨酸殘基并集中在N末端形成臂，正電荷與DNA上磷酸基負電荷互作，組蛋白C末端形成球形疏水殘基較多可與其他組蛋白及非組蛋白結(jié)合。4）組蛋白的化學(xué)修飾：組蛋白的氨基酸殘基可被乙基，甲基及磷酸基等修飾而去除了其正電荷因而與D