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熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)第1頁(yè),共19頁(yè),2023年,2月20日,星期日一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)實(shí)驗(yàn)了解熒光原位雜交技術(shù)的基本原理和在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。掌握原位雜交技術(shù)的操作方法,熟練掌握熒光顯微鏡的使用方法。第2頁(yè),共19頁(yè),2023年,2月20日,星期日二、實(shí)驗(yàn)原理FISH的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針,按照堿基互補(bǔ)的原則,與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合,形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列,因而可以將探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比,熒光原位雜交具有快速、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、雜交特異性高和可以多重染色等特點(diǎn),因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究等許多領(lǐng)域。第3頁(yè),共19頁(yè),2023年,2月20日,星期日三、實(shí)驗(yàn)用具及材料
Y染色體探針、人外周血中期染色體細(xì)胞標(biāo)本、恒溫水浴鍋、培養(yǎng)箱、染色缸、載玻片、NikonE-400、熒光顯微鏡、蓋玻片、封口膜、200μL移液器、20μL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、吐溫20。
第4頁(yè),共19頁(yè),2023年,2月20日,星期日四、實(shí)驗(yàn)方法及步驟
第5頁(yè),共19頁(yè),2023年,2月20日,星期日1.探針及標(biāo)本的變性
探針變性:標(biāo)本變性:第6頁(yè),共19頁(yè),2023年,2月20日,星期日2.雜交
DNA探針10μL滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上,蓋上18×18蓋玻片,用Parafilm封片,置于潮濕暗盒中37℃雜交過(guò)夜(約15~17h)。
第7頁(yè),共19頁(yè),2023年,2月20日,星期日3.洗脫
第8頁(yè),共19頁(yè),2023年,2月20日,星期日4.雜交信號(hào)的放大
第9頁(yè),共19頁(yè),2023年,2月20日,星期日5.封片
可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol(可使封片液產(chǎn)生自封閉作用),為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā),可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標(biāo)本可以在-20~-70的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。
第10頁(yè),共19頁(yè),2023年,2月20日,星期日6.熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果
先在可見光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野,然后打開熒光激發(fā)光源,F(xiàn)ITC的激發(fā)波長(zhǎng)為490nm。細(xì)胞被PI染成紅色,而經(jīng)FITC標(biāo)記的探針?biāo)诘奈恢冒l(fā)出綠色熒光。本實(shí)驗(yàn)使用的是Y染色體上的特異序列,因此在男性外周血染色體標(biāo)本的雜交中呈陽(yáng)性,即使在未分裂的細(xì)胞中,也可以觀察到明顯的雜交信號(hào)。照相記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
第11頁(yè),共19頁(yè),2023年,2月20日,星期日觀察結(jié)果(a)間期細(xì)胞(b)中期細(xì)胞,Y染色體熒光標(biāo)記探針
第12頁(yè),共19頁(yè),2023年,2月20日,星期日五、作業(yè)及思考題
1.通過(guò)實(shí)驗(yàn)總結(jié)熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)的技術(shù)關(guān)鍵。2.實(shí)驗(yàn)中會(huì)不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性,為什么?
第13頁(yè),共19頁(yè),2023年,2月20日,星期日第14頁(yè),共19頁(yè),2023年,2月20日,星期日第15頁(yè),共19頁(yè),2023年,2月20日,星期日第16頁(yè),共19頁(yè),2023年,2月20日,星期日第
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