核酸分子雜交技術(shù)1課件

核酸分子雜交技術(shù)

第一節(jié)核酸分子雜交的基本原理

具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對原則退火形成雙鏈的過程。

雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱探針。雜交有固一液相雜交和液相雜交。

變性復(fù)性DNA-DNA雜交雙鏈分子一、DNA變性與復(fù)性

（一）DNA變性1、定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱DNA變性3、變性后的理化性質(zhì)變化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加4、DNA變性曲線AT區(qū)先解鏈GC區(qū)后解鏈階梯式曲線5、GC含量與Tm值之間的關(guān)系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.32、復(fù)性過程（1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離（3）局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列（4）形成完整的雙鏈分子

二、影響雜交的因素1、核酸分子的濃度和長度：濃度越大，復(fù)性速度越快分子越大，復(fù)性速度越慢單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加雙鏈探針，濃度控制在0.1~0.5μg,濃度過高影響雜交效率2、溫度：（1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較Tm值低20~25℃（2）RNA/DNA或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低Tm值（3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm值低5℃4、甲酰胺：（1）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待測核酸與探針同源性不高時，加50%甲酰胺溶液在35~42℃雜交（2）如待測核酸序列與探針同源性高時，則用水溶液在68℃雜交

5、核酸分子的復(fù)雜性：（1）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序的總長度（2）Cot?與反應(yīng)體系中核酸復(fù)雜性成正比（3）兩個DNA樣品濃度絕對一致時，變性后的相對雜交率取決于DNA的相對復(fù)雜性6、非特異性雜交反應(yīng)：（1）雜交前封閉非特異性雜交位點(diǎn)，減少其對探針的非特異性吸附（2）常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉

一、Southern印跡雜交（一）待測核酸樣品的制備1、裂解或破碎細(xì)胞2、抽取純化基因組DNA3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段（二）待測DNA樣品的電泳分離1、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠分離小片段用高濃度膠2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子DNA泳動慢,小分子DNA泳動快，大小相同的分子處于同一條帶3、分子量標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)HindⅢ消化的λDNA，雜交所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記

（三）凝膠中核酸的變性（堿變化）凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的單鏈DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液

1、固相支持物的選擇（1）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性①具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的能力②不影響與探針的雜交反應(yīng)③與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固④具有良好的機(jī)械性能

非特異吸附少（2）常用的固相支持物①硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)，雜交信號本底低。缺點(diǎn)是DNA分子結(jié)合不牢固②尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸纖維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號本底高③化學(xué)活化膜：優(yōu)點(diǎn)：DNA與膜共價結(jié)合；對不同大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點(diǎn)：結(jié)合能力較上述兩種膜低2、Southern印跡的常用方法（1）毛細(xì)管虹吸印跡法

利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動，同時帶動凝膠中的DNA片段垂直向上運(yùn)動，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上（3）真空轉(zhuǎn)移法

此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時帶動核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。（五）Southern雜交1、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液2、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測DNA雜交雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的DNA

二、Northern印跡雜交1、基本原理和基本過程與Southernblot基本相同2、鑒別RNA3、探針可用DNA或RNA片段4、待測樣品為總RNA或mRNANorthern印跡與Southern印跡的不同點(diǎn)1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern印跡時，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理3、靶核酸為RNA三、斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交1、斑點(diǎn)印跡為圓形2、狹縫印跡為線狀3、鑒別DNA、RNA4、簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量四、原位雜交1、定義：將標(biāo)記的核酸探針與固定在細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA雜交保持組織細(xì)胞的形態(tài)對核酸無抽提，修飾與降解作用不改變核酸在組織細(xì)胞內(nèi)的定位不阻礙核酸與探針的雜交過程對雜交信號無遮蔽作用理化性質(zhì)穩(wěn)定2、雜交過程：（1）組織或細(xì)胞的固定理想固定液應(yīng)具備：（2）組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理去垢劑（如Tritonx-100和SDS）和蛋白酶

K去除核酸表面的蛋白質(zhì)組織細(xì)胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核酸蛋白復(fù)合體控制消化時間，避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和核酸從載玻片上脫落（3）探針的選擇與標(biāo)記以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針探針的長度一般為50~300bp,有時達(dá)1.5kb

放射性核素標(biāo)記探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定檢測結(jié)果分辨率高，但信號檢測時間長

非核素標(biāo)記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易于觀察（4）雜交雜交液體積?。?0~20μl

cDNA和RNA探針雜交溫度約為50℃

雜交時間:DNA探針雜交為2~4h.RNA探針雜交過夜

雜交前一般將組織切片置95℃5~15分鐘使DNA變性沖洗溫度一般不超過50℃（5）雜交結(jié)果檢測所用探針為核素標(biāo)記,放射自顯影檢測

所用探針為非核素標(biāo)記,比色或化學(xué)發(fā)光檢測五、液相雜交指待測核酸和探針都存在于雜交液中，堿基互補(bǔ)的單鏈核酸分子在液體中配對形成雜交分子的過程。（一）RNA酶保護(hù)分析法1、RNA酶保護(hù)分析法原理RNaseA和RNaseT1專一水解雜交體系中的單鏈RNA，不水解探針RNA與待測RNA互補(bǔ)形成的雙鏈RNA，使雜交分子得到保護(hù)，稱RNA酶保護(hù)分析法。2、雜交過程

制備待測RNARNA探針的制備與標(biāo)記：體外轉(zhuǎn)錄法制備和標(biāo)記RNA探針雜交：待測RNA與RNA探針在液相中雜交

RNaseA和RNaseTI除去單鏈RNA

電泳分離RNA

放射自顯性檢測雜交結(jié)果（二）核酸酶S1保護(hù)分析法1、原理核酸酶S1在一定條件下專一水解雜交體系中的單鏈DNA和單鏈RNA，不水解DNA探針與待測RNA雜交形成的雜交體，使雜交分子得到保護(hù)，稱核酸酶S1保護(hù)分析法2、雜交過程制備待測RNA：總RNA或mRNA均可單鏈DNA探針的制備與標(biāo)記雜交：單鏈DNA探針與待測RNA在液相中雜交核酸酶S1除去單鏈DNA和單鏈RNA

電泳分離DNA/RNA雜交體分子放射自顯影檢測雜交結(jié)果第三節(jié)探針的標(biāo)記

一、探針的種類

基因組DNA探針

cDNA探針

RNA探針

寡核苷酸探針二、標(biāo)記物（一）理想標(biāo)記物應(yīng)具備的特性：

高度靈敏性不影響堿基配對的特異性不影響探針分子的主要理化性質(zhì)對酶促反應(yīng)活性無影響或影響不大檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性(二)標(biāo)記物種類

核素標(biāo)記物：32p、35s、3H

非核素標(biāo)記物半抗原：生物素、地高率配體：生物素是親和素的配體熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等化學(xué)發(fā)光探針：標(biāo)記物與某種底物反應(yīng)發(fā)光，如生物素?；膲A性磷酸酶可使發(fā)光底物發(fā)光

三、標(biāo)記方法

體內(nèi)標(biāo)記法：將核素標(biāo)記的化合物作為合成代謝的底物，在細(xì)胞合成代謝時使核素?fù)饺氲叫潞铣傻暮怂岱肿又?，?H-胸苷可摻入到DNA中，3H-尿苷可摻入到RNA中

體外標(biāo)記法：化學(xué)標(biāo)記法：標(biāo)記物分子上的活性基因與探針分子上的某些基因反應(yīng)，標(biāo)記物直接結(jié)合到探針分子上酶促標(biāo)記法：標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記核苷酸，然后利用酶促法將標(biāo)記的核苷酸摻入到探針上

酶促標(biāo)記法（一）切口平移法（nicktranslation)1、利用DNaseI在DNA雙鏈上造成單鏈切口2、利用大腸桿菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5末端逐步切除3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互補(bǔ)的DNA單鏈為模板依次將dNTP連接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA鏈，同時將標(biāo)記的核苷酸摻入到新的DNA鏈中（二）隨機(jī)引物法

其原理是隨機(jī)引物能與各種單鏈DNA模板結(jié)合，作為合成新鏈的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA鏈，其核苷酸序列與模板DNA完全互補(bǔ)。另一單鏈DNA模板同樣合成一條新的完全互補(bǔ)的DNA鏈。合成時，帶放射性核素標(biāo)記的核苷酸摻入到新合成的DNA分子中隨機(jī)引物法所具有的優(yōu)點(diǎn)：1、能進(jìn)行雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA探針的標(biāo)記2、操作簡單方便，避免因DNaseI處理濃度掌握不當(dāng)所帶來的一系列問題3、標(biāo)記活性高，標(biāo)記活性可達(dá)108cpm/μgDNA以上4、