哺乳動物基因工程

哺乳動物基因工程哺乳動物基因工程第1頁A高等哺乳動物基因工程基礎概念9外源基因在哺乳動物細胞中表示高等哺乳動物基因工程高等哺乳動物細胞基因表示技術高等哺乳動物轉基因技術轉基因動物個體動物工程細胞哺乳動物遺傳性狀改良藥品篩選研究評價模型人體基因治療蛋白多肽物質大規(guī)模生產藥品篩選研究評價模型哺乳動物基因工程第2頁B高等哺乳動物受體系統(tǒng)9外源基因在哺乳動物細胞中表示高等哺乳動物細胞生長特征高等哺乳動物受體細胞條件高等哺乳動物受體細胞遺傳標識常見高等哺乳動物受體細胞哺乳動物基因工程第3頁高等哺乳動物細胞生長特征正常哺乳類動物細胞含有以下四大生物學特征：錨地依賴性：細胞必須附在固體上或固定表面才能生長分裂血清依賴性：細胞必須含有生長因子才能生長接觸抑制性：細胞與細胞接觸后，生長便受到抑制形態(tài)依賴性：細胞呈扁平狀，并有長纖維網狀結構上述特征使得正常哺乳動物細胞在體外培養(yǎng)中，普通只能存活50代且在培養(yǎng)皿上以平面形式生長，即單層細胞生長。有時，正常細胞會改變一些特征而越過生理臨界點，繼續(xù)增殖并無限制分裂，這種狀態(tài)稱為細胞系形成，此時細胞成為細胞系。哺乳動物基因工程第4頁高等哺乳動物受體細胞條件以高效表示外源基因為目標高等哺乳動物受體細胞應具備以下條件

細胞系特征喪失細胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大

遺傳穩(wěn)定性外源基因屢次傳代后不至于丟失，易于長久保留適當標識便于轉化株篩選和維持

生長快且齊分裂周期短，生長均一，便于控制規(guī)模培養(yǎng)大多數(shù)正常高等哺乳動物細胞并不能同時具備上述條件，癌細胞能

安全性能好不合成份泌致病物質，不致癌滿足上述前四項要求，但在安全性能上有欠缺。哺乳動物基因工程第5頁高等哺乳動物受體細胞遺傳標識營養(yǎng)缺點型哺乳動物受體細胞5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）次黃嘌呤核苷一磷酸（HMP）次黃嘌呤核苷（HR）GMPAMP尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）胸腺嘧啶核苷（TR）嘌呤核苷酸生物合成路徑嘧啶核苷酸生物合成路徑次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶（HPRT）（TK）胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤（AP）氨基喋呤（AP）從頭合成路徑補救合成路徑哺乳動物基因工程第6頁高等哺乳動物受體細胞遺傳標識營養(yǎng)缺點型哺乳動物受體細胞含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）編碼基因缺點受體細胞（tk-）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上標識基因tk能與之遺傳互補含有次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶（HPRT）編碼基因缺點受體細胞不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上標識基因hprt與之遺傳互補（hprt-）哺乳動物基因工程第7頁常見高等哺乳動物受體細胞迄今為止，用于醫(yī)療用具（藥品、抗體、診療試劑）大規(guī)模生產高等哺乳動物受體細胞主要還是中國倉鼠卵巢細胞（CHO），其優(yōu)勢有以下幾個方面：遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定與人親緣關系靠近，外源蛋白修飾準確基因轉移和載體表示系統(tǒng)完善耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)被美國FDA確認為安全基因工程受體細胞（GRAS）哺乳動物基因工程第8頁C高等哺乳動物載體系統(tǒng)9外源基因在哺乳動物細胞中表示人腺病毒DNA猴空泡病毒DNA（SV40）人乳多瘤病毒DNA（BKV）人牛痘病毒DNA哺乳動物基因工程第9頁人腺病毒DNA腺病毒科為線狀雙鏈DNA病毒，無包膜，呈二十面體，共有93個組員，分哺乳動物腺病毒和禽腺病毒兩個屬。當前已判定人腺病毒腺病毒生物學特征有6個亞屬，其中常見來構建載體主要是C亞屬2型（Ad2）和5型（Ad5）病毒。腺病毒感染人細胞時呈裂解型，不致癌；但對嚙齒目動物來說，絕大多數(shù)腺病毒組員均能致癌。哺乳動物基因工程第10頁人腺病毒DNA腺病毒基因組DNAITRITRE1E2E3E4IVa2VAL1L2L3L4L5腺病毒基因組DNA全長36kb，其包裝上限為原基因組105%，DNA兩端各有一個反向重復序列（ITR）；E1-E4為早期基因，與病毒基因組復制及晚期基因表示調控相關，其中E3編碼晚期基因調控因子，L1-L5為編碼病毒包裝蛋白晚期基因；IVa2和VA均為病毒RNA聚合酶亞基編碼基因。E3區(qū)缺失只會影響病毒顆粒成熟，不影響基因組復制功效，因而在構建載體時往往除去這個2.2kb片段，使得載體裝載量提升到4kb以上。哺乳動物基因工程第11頁人腺病毒DNA基因重排低外源基因與病毒DNA重組后能穩(wěn)定復制幾個周期腺病毒DNA載體特點安全性能好不整合人染色體DNA，不會造成惡性腫瘤宿主范圍廣對受體細胞是否處于分裂期要求不嚴格使用效果好外源基因在載體上輕易高效表示哺乳動物基因工程第12頁猴多瘤病毒DNA（SV40）

SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由VP1、VP2、VP3三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為5224bp雙鏈環(huán)狀DNASV40生物學特征SV40能夠與全部哺乳動物宿主細胞中組蛋白H2、H3、H4結合，從而使其DNA形成類似核小體微型染色體結構。

SV40感染猴細胞時呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類動物后，便發(fā)生非同源整合而致癌。哺乳動物基因工程第13頁猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40基因組DNAt/T基因編碼病毒小抗原和大SV40DNAoriVP2TVP3VP1t抗原與病毒致癌作用親密相關

SV40在裂解宿主細胞前晚期狀態(tài)時，每個宿主細胞含有105個病毒DNA拷貝，所以十分適適用于高效表示外源蛋白哺乳動物基因工程第14頁猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40DNA-質粒DNA雜合載體構建

重組SV40DNA分子必須經過包裝后才含有感染能力，所以插入外源DNA片段不能太大。為了盡可能提高SV40裝載量，必須刪除一些基因片段，所以重組SV40分子必須與野生型病毒共感染受體細胞，才能形成有感染力重組病毒顆粒。AproriviralgenegptSV40oripV2-GPTpBR322pBR322SV40pV2-GPT是一個SV40DNA與大腸桿菌質粒DNA雜合載體，其中gpt為細菌起源谷氨酸-丙氨酸轉氨酶基因，用于篩選重組子。該載體曾被成功地用于在猴腎細胞中表示有生物活性兔b-珠蛋白.哺乳動物基因工程第15頁猴多瘤病毒DNA（SV40）利用SV40DNA載體表示外源基因程序SV40載體病毒晚期基因開啟子篩選標識ori缺點SV40輔助病毒去除細菌序列插入外源基因重組分子分離病毒DNA轉化篩選增殖感染哺乳動物基因工程第16頁猴多瘤病毒DNA（SV40）基因表示好外源基因能高效表示SV40DNA載體特點基因重排高病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺失現(xiàn)象宿主范圍窄只能轉染猴細胞裝載量較小哺乳動物基因工程第17頁人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒（BKV）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其基因組為雙鏈DNA，感染宿主細胞后基因不發(fā)生整合，獨立于染色體而自人乳多瘤病毒生物學特征主復制，每個宿主細胞最高可達500個拷貝哺乳動物基因工程第18頁人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒表示載體構建BKV-E.coli穿梭載體BKVoriBKVgeneDREMMTPAprE.colioriSV40PNeor刪除編碼病毒關鍵蛋白和外殼蛋白基因，并與大腸桿菌質粒拼接，組成穿梭載體，它不能整合，同時也不能形成成熟病毒顆粒裂解受體細胞。安裝細胞色素P450dioxin介導增強子DRE，控制小鼠乳腺癌開啟子MMTP，由其帶動外源基因表示。SV40起源開啟子控制Neor

標識基因，以G418篩選重組子。以此載體在人細胞系中表示b1-干擾素和單純皰疹病毒B蛋白取得成功。哺乳動物基因工程第19頁人牛痘病毒DNA人牛痘病毒是一個大型DNA病毒，基因組長185kb，能在宿主細胞質中自主復制。以前外源基因插在病毒基因組非必需區(qū)內，構建人牛痘病毒生物學特征出重組病毒含有感染力，而且一經轉染，外源基因即可在最鄰近病毒開啟子控制下高效表示。然而因為牛痘病毒基因組較大，體外DNA重組很困難，所以通常采取體內重組方式進行。哺乳動物基因工程第20頁人牛痘病毒DNA當前廣泛使用牛痘病毒表示系統(tǒng)是一個預先構建好重組病毒其基因組上插入了一個可表示大腸桿菌T7RNA聚合酶編碼基因。在人牛痘病毒DNA表示載體構建外源基因導入受體細胞之前，先以上述重組病毒感染細胞，使其大量表示T7RNA聚合酶，然后再將含有外源基因和T7開啟子細菌型重組質粒導入哺乳動物受體細胞，此時外源基因整合在受體細胞染色體DNA上，并在T7RNA聚合酶作用下表示出重組蛋白。人囊狀纖維化基因就是采取這種戰(zhàn)略高效表示。哺乳動物基因工程第21頁人牛痘病毒DNA利用人牛痘病毒載體表示外源基因程序牛痘病毒開啟子T7RNA聚合酶基因T7開啟子外源基因細菌重組質粒感染轉化培養(yǎng)搜集哺乳動物基因工程第22頁D高等哺乳動物基因轉移9外源基因在哺乳動物細胞中表示哺乳動物細胞物理轉化法哺乳動物細胞病毒轉染法哺乳動物基因工程第23頁哺乳動物細胞物理轉化法利用物理方法轉化高等哺乳動物細胞主要優(yōu)點是外源基因表示盒中不含任何病毒基因序列，這對外源基因表示產物分離純化減輕了負擔。但外源基因表示盒進入受體細胞后，往往以多拷貝形式隨機整合在染色體DNA上，造成受體細胞基因滅活、外源基因不表示。哺乳動物基因工程第24頁哺乳動物細胞物理轉化法將待轉化DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入CaCl2溶液混勻，此時DNA被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內；此時細胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣晶體局部溶解膜結構，DNA便進入受體細胞；磷酸鈣共沉淀法將上述制備顆粒懸浮液滴入細胞培養(yǎng)皿中，37℃保溫4-16小時棄去DNA溶液，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7天即可篩選轉化株。假如在外源DNA中摻入少許受體細胞內源性DNA能夠提升轉化效率。利用磷酸鈣共沉淀法轉化腫瘤病毒DNA，可使正常細胞轉化為癌細胞，這是大家對腫瘤發(fā)生機制最早了解。哺乳動物基因工程第25頁哺乳動物細胞物理轉化法將待轉化DNA溶解受體細胞懸浮液中，然后加入電擊轉化儀樣品槽內，兩端施加瞬時高壓電場，使細胞膜產生細小縫隙，此時電擊轉化法常見于對磷酸鈣共沉淀法無效細胞類型，如生長在懸浮液中淋巴細胞等。電擊轉化法DNA片段便可不經過胞飲作用直接進入受體細胞。哺乳動物基因工程第26頁哺乳動物細胞物理轉化法將待轉化DNA溶解與天然或人工合成磷脂混合，后者在表面活性劑存在下形成包埋水相DNA脂質體結構。合，DNA隨即進入胞質和核內。利用上述程序曾將外源基因成功地導入了小鼠淋巴細胞和HeLa脂質體介導法將這種脂質體懸浮液加入到細胞培養(yǎng)液中，便會與受體細胞膜融細胞。哺乳動物基因工程第27頁哺乳動物細胞物理轉化法經過激素療法使雌鼠超數(shù)排卵，并與雄性小鼠交配，然后殺死雌鼠，從其輸卵管內取出受精卵；性原核內。上述程序多用于動物個體轉基因過程，因為必須單細胞逐一操顯微注射法借助于顯微鏡將純化DNA溶液快速注入到受精卵中變大了雄作，所以不太適合用于基因克隆和表示。哺乳動物基因工程第28頁哺乳動物細胞物理轉化法

血影細胞是指哺乳動物紅細胞在機械作用、病毒誘導、低滲環(huán)境下發(fā)生溶血，血紅蛋白大量溢出，最終形成僅被細胞膜包裹細胞同時，外源DNA也輕易進入。當上述外界條件消失后，紅細胞膜又可恢復原來通透性。所以，可先將外源DNA轉入血影細胞，然后再將血影細胞介導法核結構。在溶血過程中，紅細胞膜通透性大增，在血紅蛋白溢出血影細胞與受體細胞在適當條件下發(fā)生融合，從而將外源DNA轉入受體細胞。哺乳動物基因工程第29頁哺乳動物細胞病毒轉染法以病毒DNA為載體能夠將外源基因直接轉染或與野生型病毒顆粒共轉染特定受體細胞。這種方法含有定向性好、試驗重復性佳、導入效率高等優(yōu)點，但也存在一定缺點，如當前常見載體宿主范圍有限，往往無法轉染一些含有主要經濟價值家禽和牲畜細胞等。哺乳動物基因工程第30頁E利用哺乳動物工程細胞生產重組蛋白9外源基因在哺乳動物細胞中表示哺乳動物細胞高效表示外源蛋白基礎原理利用哺乳動物工程細胞生產人源化小鼠抗體利用哺乳動物工程細胞生產人組織型纖溶酶原激活劑利用哺乳動物工程細胞生產人凝血因子VIII哺乳動物基因工程第31頁哺乳動物細胞高效表示外源蛋白基礎原理基因擴增是外源基因在哺乳動物細胞內高效穩(wěn)定表示一個特殊方式。氨甲喋呤（MTX）是動物細胞中關鍵代謝酶二氫葉酸還原酶數(shù)細胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來抗性細胞中，dhfr基因均得以擴增。這些抗性細胞正是經過增加相關基因拷貝數(shù)、提升關鍵代謝酶經過強化基因擴增高效表示外源基因（DHFR）特異性抑制劑，細胞培養(yǎng)物經氨甲喋呤處理后，絕大多表示水平，從而抵消氨甲喋呤抑制效應。更主要是，擴增區(qū)哺乳動物細胞內基因擴增現(xiàn)象域遠遠大于dhfr基因本身，即與dhfr基因相鄰DNA區(qū)域同時被擴增。哺乳動物基因工程第32頁哺乳動物細胞高效表示外源蛋白基礎原理經過強化基因擴增高效表示外源基因DHFR-MTX高效表示系統(tǒng)外源基因dhfr轉染dhfr-細胞系單克隆培養(yǎng)轉移0.05mMMTX培養(yǎng)單克隆轉移培養(yǎng)單克隆轉移5mMMTX0.25mMMTX培養(yǎng)單克隆外源基因擴增至100拷貝哺乳動物基因工程第33頁哺乳動物細胞高效