熒光光度分析法測定維生素B專家講座

熒光分析法簡述指導(dǎo)教師：趙成國熒光光度分析法測定維生素B專家講座第1頁一、概述

什么是熒光呢？當(dāng)一些物質(zhì)被光照射后，它會吸收一定頻率光，而發(fā)射出波長更長光，當(dāng)光停頓時，發(fā)射光也隨即消失，這就是熒光現(xiàn)象，它發(fā)出光就叫熒光。第一次發(fā)覺熒光現(xiàn)象是16世紀(jì)西班牙內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家莫納德斯

（N.Monardes）,在一個木頭切片水溶液中，看到了極為可愛天藍(lán)色，以此開始了熒光研究。熒光光度分析法測定維生素B專家講座第2頁

直到1852年在考查奎寧和葉綠素?zé)晒鈺r，用分光計(jì)觀察到其熒光波長比入射光波長稍長些，才判明這種現(xiàn)象是這些物質(zhì)在吸收光能后重新發(fā)射不一樣波長光，而不是由光漫射作用所引發(fā)，才確立了熒光是光發(fā)射概念。到19世紀(jì)末人們已經(jīng)知道了包含熒光素、曙紅、多環(huán)芳烴等600種以上熒光物質(zhì)。

熒光光度分析法測定維生素B專家講座第3頁20世紀(jì)以來，熒光現(xiàn)象被研究得更多了，發(fā)覺了共振熒光、增感熒光，能夠進(jìn)行熒光產(chǎn)率得絕對測定，還進(jìn)行了熒光壽命直接測定等等。

熒光光度分析法測定維生素B專家講座第4頁二、熒光發(fā)生機(jī)理

當(dāng)一些物質(zhì)被光照射后，物質(zhì)分子吸收光以后，便以基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，成為激發(fā)分子，然后經(jīng)過相互碰撞或和其它溶劑分子碰撞等去活化過程而消耗了能量，回到第一激發(fā)態(tài)最低振動能級，這種躍遷稱為無輻射躍遷，它不會發(fā)光。當(dāng)電子由激發(fā)態(tài)最低振動能級躍遷回基態(tài)不一樣振動能級時，則以熒光形態(tài)發(fā)出能量。熒光光度分析法測定維生素B專家講座第5頁1.激發(fā)通常在室溫下物質(zhì)分子大部分處于基態(tài)最低振動能級（

=0）。當(dāng)電子吸收一定頻率電磁輻射發(fā)生能級躍遷時，可上升至不一樣激發(fā)態(tài)各振動能級，其中大部分分子上升至第一激發(fā)單重態(tài)（S1

），這一過程稱為激發(fā)。熒光光度分析法測定維生素B專家講座第6頁2.去活化過程處于激發(fā)態(tài)分子是不穩(wěn)定，它能夠經(jīng)過不一樣路徑回到基態(tài)，這一過程稱為去活化。去活化過程有以下幾個：（1）振動馳豫溶液中分子間碰撞機(jī)會很多，經(jīng)過碰撞溶質(zhì)分子將過剩能量轉(zhuǎn)移給溶劑分子，經(jīng)過非輻射躍遷而降至同一能態(tài)最低振動能級，這一過程稱為振動馳豫。熒光光度分析法測定維生素B專家講座第7頁

（2）內(nèi)部轉(zhuǎn)換

同一多重態(tài)不一樣電子能級間可能發(fā)生內(nèi)部轉(zhuǎn)換。S2S1或T2T1

條件：當(dāng)S2較低振動能級與S1較高振動能級能量相當(dāng)，且發(fā)生重合時分子才有可能S2S1或T2T1熒光光度分析法測定維生素B專家講座第8頁

（3）熒光發(fā)射處于第一激發(fā)最低振動能級分子，躍遷回基態(tài)各振動能級，這一過程稱為熒光發(fā)射。熒光光度分析法測定維生素B專家講座第9頁

（4）體系間跨越躍遷分子從激發(fā)單重態(tài)轉(zhuǎn)至能量較低激發(fā)三重態(tài)過程，稱體系間跨越躍遷。三重態(tài)：電子自旋方向相同單重態(tài):電子自旋方向相反

這些分子從第一激發(fā)三重態(tài)最低振動能級下降至第一基態(tài)各振動能級，所發(fā)出輻射即為磷光。熒光光度分析法測定維生素B專家講座第10頁熒光光度分析法測定維生素B專家講座第11頁1.激發(fā)光譜和發(fā)射光譜任何熒光化合物都有兩個特征性光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（1）激發(fā)光譜繪制激發(fā)光譜時，固定熒光最大發(fā)射波長，然后改變激發(fā)光波長，所測得熒光強(qiáng)度與激發(fā)波長譜線關(guān)系即為激發(fā)光譜。三、熒光特征熒光光度分析法測定維生素B專家講座第12頁

（2）發(fā)射光譜發(fā)射光譜簡稱熒光光譜。繪制發(fā)射光譜時，固定熒光最大激發(fā)波長，然后改變發(fā)射光波長，所測得熒光強(qiáng)度與發(fā)射波長譜線關(guān)系即為發(fā)射光譜。熒光光度分析法測定維生素B專家講座第13頁2.熒光光譜形狀與激發(fā)波長無關(guān)因?yàn)榉肿硬徽摫患ぐl(fā)到高于S1哪一個激發(fā)態(tài)，都經(jīng)過無輻射振動馳豫或內(nèi)部轉(zhuǎn)換等過程，最終回到S1態(tài)最低振動能級，然后躍遷回基態(tài)產(chǎn)生熒光。熒光光度分析法測定維生素B專家講座第14頁3.吸收光譜和熒光光譜有很好鏡像關(guān)系因?yàn)榉肿覵0態(tài)和S1態(tài)中各振動能級能量分布情況相同決定。所以吸收光譜和發(fā)射光譜形狀相同。蒽吸收光譜和發(fā)射光譜—吸收光譜—發(fā)射光譜熒光光度分析法測定維生素B專家講座第15頁四、熒光與分子結(jié)構(gòu)關(guān)系

（１）發(fā)光分子中要含有共軛π鍵體系共軛程度越大，π電子越輕易激發(fā)，分子放光越輕易產(chǎn)生。（2）含有剛性平面結(jié)構(gòu)分子有利于熒光發(fā)射分子共平面越大，其π電子共軛程度越大。如熒光素和酚酞結(jié)構(gòu)十分相同，熒光素有很強(qiáng)熒光，而酚酞沒有，這是因?yàn)闊晒馑赜袆傂云矫娼Y(jié)構(gòu)，降低了分子振動，降低了去活化概率。熒光光度分析法測定維生素B專家講座第16頁（3）取代基作用

給電子基增強(qiáng)熒光:－OH,－NH2,－NHR,－NR2,－C≡N

吸電子基減弱熒光：－Br,－Cl,－

NO2,

－N＝N,－COOH

熒光光度分析法測定維生素B專家講座第17頁五、影響熒光強(qiáng)度原因1.熒光減退熒光物質(zhì)經(jīng)紫外線長時間照射及空氣氧化作用，會使熒光逐步減退。2.熒光強(qiáng)度與溶液濃度關(guān)系在稀溶液中：F＝Kc

F

為熒光強(qiáng)度K—檢測效率（由儀器決定）c

為液體濃度熒光光度分析法測定維生素B專家講座第18頁Fc

高濃度時，熒光物質(zhì)發(fā)生熄滅和自吸收現(xiàn)象，使F與c不呈線性關(guān)系熒光光度分析法測定維生素B專家講座第19頁3.溫度影響溫度對熒光強(qiáng)度影響較敏感。溶液溫度下降時，介質(zhì)粘度增大，熒光物質(zhì)與分子碰撞也隨之降低，去活化過程也降低，則熒光強(qiáng)度增加。相反，伴隨溫度上升，熒光物質(zhì)與分子碰撞頻率增加，使去活化幾率增加，則熒光強(qiáng)度下降。熒光光度分析法測定維生素B專家講座第20頁

帶有酸性或堿性官能團(tuán)大多數(shù)芳香族化合物熒光普通都與溶液PH值相關(guān)，比如：在pH=7~12溶液中苯胺以分子形式存在，會發(fā)出藍(lán)色熒光；而在pH<2或pH>13溶液中苯胺以離子形式存在，都不會發(fā)出熒光。同時所用酸種類也影響熒光強(qiáng)度，比如：奎寧在硫酸溶液中熒光比在鹽酸中要強(qiáng)。4.pH影響熒光光度分析法測定維生素B專家講座第21頁

許多有機(jī)物及金屬有機(jī)絡(luò)合物，在乙醇溶液中熒光比在水溶液中強(qiáng)。乙醇、甘油、丙酮、氯仿及苯都是慣用有機(jī)溶劑，其中大多有熒光，應(yīng)設(shè)法防止；普通防止方法是稀釋，或加入一部分水。5.溶劑熒光光度分析法測定維生素B專家講座第22頁6.熒光強(qiáng)度到達(dá)最高點(diǎn)所需要時間不一樣，有反應(yīng)加入試劑后熒光強(qiáng)度馬上到達(dá)最高峰。有反應(yīng)需要經(jīng)過15~30分鐘才能到達(dá)最高峰。7.有機(jī)溶劑中常有產(chǎn)生熒光雜質(zhì)，可用蒸餾法提純。橡皮塞、軟木塞及濾紙中也常有能溶于溶劑一些帶熒光物質(zhì)。熒光光度分析法測定維生素B專家講座第23頁

包含有光源、單色器、樣品池、檢測器和統(tǒng)計(jì)顯示裝置五個部分。六、熒光分析儀器基本組成部件熒光光度分析法測定維生素B專家講座第24頁

激發(fā)光源應(yīng)含有足夠強(qiáng)度、適用波長范圍寬、穩(wěn)定等特點(diǎn)。慣用光源有高壓汞燈和氙弧燈。

氙弧燈又稱氙燈，是當(dāng)前熒光分光分度計(jì)中應(yīng)用最廣泛一個光源。它是一個短弧氣體放電燈，外套為石英，內(nèi)充氙氣，光強(qiáng)度大氙燈燈內(nèi)氣壓高，開啟時電壓高（2040KV）,所以使用時一定要注意安全。1.激發(fā)光源

熒光光度分析法測定維生素B專家講座第25頁

熒光分析儀中應(yīng)用最多單色器為光柵單色器

單色器有兩塊：第一塊為激發(fā)單色器，用于選擇激發(fā)光波長；第二塊為發(fā)射單色器，用于選擇熒光發(fā)射波長。普通后者光柵閃耀波長比前者來得長一些。第一濾光片用以分離出所需用激發(fā)光，第二濾光片用以濾去雜散光、拉曼光和雜質(zhì)所發(fā)射熒光。2.單色器熒光光度分析法測定維生素B專家講座第26頁

熒光分析比色皿通慣用石英材料做成，熒光比色皿四面均為磨光透明面，同時普通僅有一個厚度為1cm液池。

3.樣品池

熒光光度分析法測定維生素B專家講座第27頁4.檢測器

熒光計(jì)多采取光電倍增管進(jìn)行檢測。檢測器方向應(yīng)與激發(fā)光方向成直角，以消除樣品池中透射光和雜散光干擾。熒光光度分析法測定維生素B專家講座第28頁5.統(tǒng)計(jì)、顯示裝置

熒光儀讀出裝置有數(shù)字電壓表或統(tǒng)計(jì)儀。當(dāng)代儀器都配上計(jì)算機(jī)，進(jìn)行自動控制和顯示熒光光譜及各種參數(shù)。熒光光度分析法測定維生素B專家講座第29頁熒光分析儀

光源樣本池第一（激發(fā)）單色器第二（發(fā)射）單色器檢驗(yàn)器顯示、統(tǒng)計(jì)裝置熒光光度分析法測定維生素B專家講座第30頁七、熒光測定方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法將已知量標(biāo)準(zhǔn)物經(jīng)過與試樣相同處理后，配成一定濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，并測定他們熒光強(qiáng)度，繪制一條以熒光強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測定未知樣濃度。熒光光度分析法測定維生素B專家講座第31頁（2）熒光猝滅法在普通熒光分析中，熒光猝滅現(xiàn)象是不可防止，不過我們能夠利用猝滅現(xiàn)象，進(jìn)行熒光分析。比如一物質(zhì)本身不會發(fā)光，也不會與其它物質(zhì)形成熒光物質(zhì)，但它會使另外一個會發(fā)射熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度降低，熒光強(qiáng)度下降程度與該物質(zhì)濃度成百分比，此法成為熒光猝滅法。熒光光度分析法測定維生素B專家講座第32頁1.特點(diǎn)靈敏度高：測定下限0.1～0.001μg·mL-1,比分光光度法高2～4個數(shù)量級.

儀器設(shè)備相對簡單、體積小操作較簡便反應(yīng)時間也較快八、熒光分析法特點(diǎn)及應(yīng)用熒光光度分析法測定維生素B專家講座第33頁

生物化學(xué)分析、生理醫(yī)學(xué)研究、臨床檢測（1)直接測定能產(chǎn)生熒光物質(zhì)帶苯環(huán)氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸

(2)測定能與熒光試劑反應(yīng)生成熒光化合物物質(zhì)熒光生色團(tuán)標(biāo)識蛋白質(zhì)，研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；致癌物同核酸結(jié)合常引發(fā)顯著熒光

(3)熒光熄滅法測定猝滅劑2.熒光光度法應(yīng)用熒光光度分析法測定維生素B專家講座第34頁試驗(yàn)一熒光法測定醫(yī)用維生素B2中核黃素含量1.學(xué)習(xí)和掌握熒光光度分析法基本原理和方法2.學(xué)會使用熒光分光度計(jì)一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：熒光光度分析法測定維生素B專家講座第35頁

核黃素易溶于水而不溶于乙醚等有機(jī)溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對熱穩(wěn)定。核黃素在堿性溶液中經(jīng)光線照射會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，光黃素?zé)晒獗群它S素?zé)晒鈴?qiáng)多，故測核黃素時溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進(jìn)行。

二、試驗(yàn)原理熒光光度分析法測定維生素B專家講座第36頁

化學(xué)名：7,8-二甲基－10［(2S,3S,4R)-2,3,4,5-四羥基戊基］苯并蝶啶-2,4（3H，10H）-二酮

分子式：C17H20N4O6

分子量：376.36

熒光光度分析法測定維生素B專家講座第37頁三、試驗(yàn)儀器RF-5301PC熒光光度計(jì)日本島津企業(yè)

熒光光度分析法測定維生素B專家講座第38頁1.儀器介紹擁有世界最高水平S/N，可到達(dá)150以上。最適合高靈敏度、高分辨率測定。其主要參數(shù)和特點(diǎn)①測定范圍：220~900nm②帶寬：1.5、3、5、10、20nm③靈敏度：S/N>150④測定方式：定性分析、同時光譜分析、定量分析、時間過程測定。熒光光度分析法測定維生素B專家講座第39頁①打開電腦和RF-5301系統(tǒng)開關(guān)，點(diǎn)擊桌面RF-5301快捷圖標(biāo)，開啟儀器控制程序②從“AcquireMode”菜單中選[Spectrum光譜]，進(jìn)入光譜模式。2.操作規(guī)程熒光光度分析法測定維生素B專家講座第40頁③從“Configure設(shè)置”菜單中選擇[Parameters參數(shù)]熒光光度分析法測定維生素B專家講座第41頁

若樣品激發(fā)光譜發(fā)射波長或發(fā)射光譜激發(fā)波長未知，則在上述對話框中設(shè)置適當(dāng)激發(fā)發(fā)射狹縫寬度，靈敏度，放置標(biāo)樣，在光度計(jì)按鍵中點(diǎn)擊，在彈出對話框中選擇激發(fā)光和發(fā)射光范圍以及激發(fā)光波長間隔，點(diǎn)“Search”鍵，等候一段時間，由儀器給出最優(yōu)波長。熒光光度分析法測定維生素B專家講座第42頁④掃描完成后出現(xiàn)譜圖熒光光度分析法測定維生素B專家講座第43頁⑤定量分析參數(shù)設(shè)置設(shè)置激發(fā)發(fā)射光波長，激發(fā)發(fā)射狹縫寬度，靈敏度，反應(yīng)時間，單位，濃度以及強(qiáng)度范圍。

熒光光度分析法測定維生素B專家講座第44頁⑥將裝有蒸餾水樣品池放入池槽中，點(diǎn)擊“”自動回零。⑦將第一個標(biāo)準(zhǔn)樣品裝入池槽中，點(diǎn)擊彈出以下對話框，輸入標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度熒光光度分析法測定維生素B專家講座第45頁⑧以此測完5個標(biāo)準(zhǔn)樣品后，屏幕上會出現(xiàn)工作曲線，也會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。熒光光度分析法測定維生素B專家講座第46頁

⑨在工作曲線繪制完成后，能夠定量測定未知樣濃度，點(diǎn)擊。然后將未知樣品放入池槽中，點(diǎn)擊開始濃度測定。熒光光度分析法測定維生素B專家講座第47頁最終，在File菜單中選擇Save，儲存取得數(shù)據(jù)熒光光度分析法測定維生素B專家講座第48頁

1.10.0μg·mL-1核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：稱取0.01g核黃素置于50mL燒杯中，以蒸餾水溶解后，定溶于1000mL容量瓶中，搖勻，備用。

四、試驗(yàn)試劑熒光光度分析法測定維生素B專家講座第49頁1.配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液

取4個50ml容量瓶，分別加入1.00，2.00，3.00，4.00ml核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋至刻度，搖勻。2.掃描核黃素最大激發(fā)波長和發(fā)射波長對核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行熒光掃描，依據(jù)激發(fā)光譜曲線和發(fā)射光譜曲線，確定最大激