紙層析法分離鑒定氨基酸專家講座

181試驗(yàn)一紙層析法分離判定氨基酸經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，掌握紙層析基本操作技能。加深對(duì)分配層析原理了解。【一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)】紙層析法分離鑒定氨基酸專家講座第1頁(yè)182

【二、試驗(yàn)原理】

層析技術(shù)是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)差異，使各組分以不一樣程度分布在兩相中，其中一相為固定相，另一相流過(guò)此相當(dāng)作流動(dòng)相，并使各組分以不一樣速度移動(dòng)，從而到達(dá)分離目標(biāo)?？煞蛛x物質(zhì)糖類、有機(jī)酸、氨基酸、核苷等紙層析法分離鑒定氨基酸專家講座第2頁(yè)183固定相

在層析中起分離作用而不隨層析過(guò)程移動(dòng)物質(zhì)。如紙層析中固定相是濾紙纖維中結(jié)合水。固定相被看成是樣品移動(dòng)阻力。流動(dòng)相

在層析過(guò)程因其本身流動(dòng)而推進(jìn)樣品移動(dòng)物質(zhì)。紙層析法分離鑒定氨基酸專家講座第3頁(yè)184名稱操作方式固定相流動(dòng)相分離依據(jù)

分配層析

紙層析薄層層析液體液體

溶解度

離子交換層析

離子交換柱層析固體液體

帶電性靜電引力

吸附層析

吸附薄層層析氣體吸附層析固體液體氣體

吸附力

親和層析

酶與底物抗原與抗體固體液體

配體專一性

凝膠層析

凝膠過(guò)濾固體液體

分子大小層析分類紙層析法分離鑒定氨基酸專家講座第4頁(yè)185

分配層析：是利用不一樣物質(zhì)在兩種不相溶溶劑中分配系數(shù)不一樣而到達(dá)分離一個(gè)技術(shù)。分配系數(shù)=溶質(zhì)在固定相溶解度溶質(zhì)在流動(dòng)相溶解度紙層析法分離鑒定氨基酸專家講座第5頁(yè)186

紙層析是以濾紙作為惰性支持物分配層析：紙纖維上–OH

基含有親水性，所以能吸附一層水作為固定相，而通常把有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。流動(dòng)相流經(jīng)支持物時(shí)與固定相間連續(xù)抽提，使物質(zhì)在兩相間不停地分配而得到分離。紙層析法分離鑒定氨基酸專家講座第6頁(yè)187

溶質(zhì)在濾紙上移動(dòng)速率用Ｒf（比移）值來(lái)表示：

展層層斑點(diǎn)中心與原點(diǎn)間距離

Rf=--------------------------------------------

溶劑前沿與原點(diǎn)之間距離紙層析法分離鑒定氨基酸專家講座第7頁(yè)188紙層析法分離鑒定氨基酸專家講座第8頁(yè)189

影響Rf值原因（各種）物質(zhì)結(jié)構(gòu)與極性物質(zhì)極性大小決定了物質(zhì)在水和有機(jī)溶劑之間分配情況。pH值

展層劑pH影響被分離物質(zhì)極性基團(tuán)解離形式。

層析濾紙質(zhì)量層析用濾紙要質(zhì)地均勻，緊密，有一定機(jī)械強(qiáng)度，并含雜質(zhì)少。國(guó)產(chǎn)新華濾紙可用于普通紙層析。紙層析法分離鑒定氨基酸專家講座第9頁(yè)1810【三、器材與試劑】

器材：

1、層析缸

2、毛細(xì)管3、噴霧器4、培養(yǎng)皿

5、層析濾紙(新華一號(hào))

試劑：

1、擴(kuò)展劑

（正丁醇：水：冰醋酸=4：3：1）

2、顯色劑

0.1％茚三酮正丁醇溶液。

3、氨基酸溶液

0.5％賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸溶液及它們混合液紙層析法分離鑒定氨基酸專家講座第10頁(yè)1811

1、層析濾紙準(zhǔn)備：取層析濾紙(長(zhǎng)20cm、寬15cm)一張。在紙一端距邊緣2～3cm處用鉛筆劃一條直線，在此直線上每間隔2cm作一記號(hào)。

2、點(diǎn)樣：用毛細(xì)管將各氨基酸樣品分別點(diǎn)在這5個(gè)位置上，干后再點(diǎn)一次。每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散直徑，最大不超出3mm?！舅摹⒃囼?yàn)步驟】紙層析法分離鑒定氨基酸專家講座第11頁(yè)18123、擴(kuò)展

：用線將濾紙縫成筒狀，紙兩邊不能接觸。將濾紙直立于培養(yǎng)皿中（點(diǎn)樣一端在下，擴(kuò)展劑液面需低于點(diǎn)樣線1cm）。待溶劑上升約15cm時(shí)即取出濾紙，鉛筆描出溶劑前沿界限，自然干燥或用吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)吹干。

4、顯色：用噴霧器均勻噴上0。1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分鐘(100℃)或用熱風(fēng)吹干即可顯出各層析斑點(diǎn)。

5、計(jì)算Rf值紙層析法分離鑒定氨基酸專家講座第12頁(yè)1813【五、試驗(yàn)結(jié)果與分析】【六、注意事項(xiàng)】【七、思索題】1、試驗(yàn)中作為固定相和流動(dòng)相物質(zhì)分別是什么？2、Rf值含義、影響原因？

下次試驗(yàn)：試驗(yàn)二

蛋白質(zhì)和氨基酸顏色反應(yīng)值日生值日紙層析法分離鑒定氨基酸專家講座第13頁(yè)1814小試驗(yàn)當(dāng)濾紙接觸到溶劑時(shí)，溶液將上升。濾紙上小圓點(diǎn)是4種不一樣氨基酸混合物。看看接下來(lái)會(huì)發(fā)生什么事情…紙層析法分離鑒定氨基酸專家講座第14頁(yè)1815能夠看出1號(hào)氨基酸上升最高，在濾紙上跑得最快。而4號(hào)氨基酸與濾紙結(jié)合最緊，所以跑速度比其它氨基酸慢。1234紙層析法分離鑒定氨基酸專家講座第15頁(yè)1816這就是紙色譜法。對(duì)照上圖，可知道1-4號(hào)各代表什么氨基酸。紙色譜法是分離判定蛋白質(zhì)氨基酸組成主要工具。