流式細(xì)胞儀工作原理

流式細(xì)胞儀工作原理流式細(xì)胞儀工作原理第1頁FACSCalibur流式細(xì)胞儀工作原理第2頁綱領(lǐng)試驗設(shè)計原理流式細(xì)胞儀運作原理FACSCalibur

操作流程流式細(xì)胞儀工作原理第3頁IntroductionoftheexperimentdesignforFlowCytometry藉由螢光抗體標(biāo)識細(xì)胞之抗原特征藉由螢光化合物標(biāo)識細(xì)胞特征藉由螢光染劑標(biāo)識細(xì)胞特征藉由螢光蛋白標(biāo)識細(xì)胞特征CytometryBeadsArray流式細(xì)胞儀工作原理第4頁單一細(xì)胞特征之偵測流式細(xì)胞儀工作原理第5頁單一細(xì)胞特征之偵測AdhesionReceptorsMetaboliccytokinesstructureenzymes流式細(xì)胞儀工作原理第6頁LysedWholeBloodComponentsGranulocytesMonocytesEosinophilsBasophilsNeutrophilsLymphocytesTBNKTHelperTCytotoxicPeripheralWhiteBloodCellsCD45+CD3+CD4+CD3+CD8+CD3+CD3-CD19+HLA-DR+CD3-CD16+CD56+Monocytes流式細(xì)胞儀工作原理第7頁Example流式細(xì)胞儀工作原理第8頁信息傳導(dǎo)流式細(xì)胞儀工作原理第9頁BD?PhosFlowforWholeBloodorPBMCSamples流式細(xì)胞儀工作原理第10頁Mappingnormalandcancercellsignallingnetworks:towardssingle-cellproteomics.NatRevCancer.Feb;6(2):146-55流式細(xì)胞儀工作原理第11頁DevelopmentOfVisualizationToolsNolanetal.流式細(xì)胞儀工作原理第12頁IrishJM,HovlandR,KrutzikPO,PerezOD,BruserudO,GjertsenBT,NolanGP.

Singlecellprofilingofpotentiatedphospho-proteinnetworksincancercells.Cell.Jul23;118(2):217-28.ClusteringofBiosignature,ClinicalSignificance流式細(xì)胞儀工作原理第13頁試驗設(shè)計原理藉由螢光抗體標(biāo)識細(xì)胞之抗原特征藉由螢光化合物標(biāo)識細(xì)胞特征藉由螢光染劑標(biāo)識細(xì)胞特征藉由螢光蛋白標(biāo)識細(xì)胞特征CytometryBeadsArray流式細(xì)胞儀工作原理第14頁AnnexinVAssay流式細(xì)胞儀工作原理第15頁FlowCytometricAnalysisofApoptosis

inJurkatTCellsRelativeCellNumberAnnexinVPE00.5124IncubationwithCamptothecin(hr)流式細(xì)胞儀工作原理第16頁Fas-inducedApoptosisinJurkatCellsPIAnnexinV-FITC流式細(xì)胞儀工作原理第17頁試驗設(shè)計原理藉由螢光抗體標(biāo)識細(xì)胞之抗原特征藉由螢光化合物標(biāo)識細(xì)胞特征藉由螢光染劑標(biāo)識細(xì)胞特征藉由螢光蛋白標(biāo)識細(xì)胞特征CytometryBeadsArray流式細(xì)胞儀工作原理第18頁DNA特異性染劑N+C2H5NH2NH2EthidiumN+C2H2)3NH2NH2N+C2H5CH3C2H5Propidium流式細(xì)胞儀工作原理第19頁G2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNAcontentCount2N4N細(xì)胞周期位相決定流式細(xì)胞儀工作原理第20頁SubG1流式細(xì)胞儀工作原理第21頁細(xì)胞增殖反應(yīng)流式細(xì)胞儀工作原理第22頁細(xì)胞增殖反應(yīng)流式細(xì)胞儀工作原理第23頁試驗設(shè)計原理藉由螢光抗體標(biāo)識細(xì)胞之抗原特征藉由螢光化合物標(biāo)識細(xì)胞特征藉由螢光染劑標(biāo)識細(xì)胞特征藉由螢光蛋白標(biāo)識細(xì)胞特征CytometryBeadsArray流式細(xì)胞儀工作原理第24頁GFPasReporter流式細(xì)胞儀工作原理第25頁GFPasaReporter流式細(xì)胞儀工作原理第26頁GFPasaReporterTheUsageofGFP流式細(xì)胞儀工作原理第27頁Gervaix,A.et.al.1997.AnewreportercelllinetomonitorHIVinfectionanddrugsusceptibilityinvitro.PNASvol.94.GFPasaReporter流式細(xì)胞儀工作原理第28頁GFPasaReporter流式細(xì)胞儀工作原理第29頁試驗設(shè)計原理藉由螢光抗體標(biāo)識細(xì)胞之抗原特征藉由螢光化合物標(biāo)識細(xì)胞特征藉由螢光染劑標(biāo)識細(xì)胞特征藉由螢光蛋白標(biāo)識細(xì)胞特征CytometryBeadsArray流式細(xì)胞儀工作原理第30頁CytometricBeadsArray(CBA)SingleStepIncubationTwo-StepIncubationor流式細(xì)胞儀工作原理第31頁BeadsProvideaFlexiblePlatformMultiplesizesBeadsprovideanexpandableassayplatformforusewithaflowcytometerDifferentintensities*Differentcolorswithdifferentintensities流式細(xì)胞儀工作原理第32頁ProteinsMeasuredA.Interleukin(IL)-2B.IL-4C.IL-5D.IL-10E.TumorNecrosisFactor-aF.Interferon-g

流式細(xì)胞儀工作原理第33頁Zap70Detection.流式細(xì)胞儀工作原理第34頁KineticanalysisofTcellactivationbyanti-CD3/CD28流式細(xì)胞儀工作原理第35頁PhiladelphiachromosomeThepresenceofthistranslocationisahighlysensitivetestforCML,since95%ofpeoplewithCMLhavethisabnormality流式細(xì)胞儀工作原理第36頁Philadelphiachromosome流式細(xì)胞儀工作原理第37頁緩沖液液流區(qū)緩沖液液流區(qū)樣品流動區(qū)偵測區(qū)激發(fā)光源螢光散射光流式細(xì)胞儀工作原理流式細(xì)胞儀工作原理第38頁流式細(xì)胞儀能測量:散射光細(xì)胞大小(前方散射光)細(xì)胞折射率(側(cè)方散射光)各色螢光流式細(xì)胞儀工作原理第39頁液流系統(tǒng):將細(xì)胞依序送到測量區(qū)受檢。光學(xué)系統(tǒng):產(chǎn)生并搜集螢光、光散射等信號。電子系統(tǒng):將光學(xué)訊號轉(zhuǎn)換成電子訊號。分析所輸出電流訊號，以脈沖高度、寬度、積分面積顯示。量化訊號并傳至電腦。綜合三個系統(tǒng)功效:流式細(xì)胞儀工作原理第40頁綜合三個系統(tǒng)功效-液流系統(tǒng)流式細(xì)胞儀工作原理第41頁FACSCalibur液流系統(tǒng)流式細(xì)胞儀工作原理第42頁FACSCalibur儀表板LO=12uL/minMED=35uL/minHI=60uL/minPRIME=Drain&FillSTANDBYRUN流式細(xì)胞儀工作原理第43頁redlaserbluelaserLowSamplePressureHighSamplePressuresheathsheathsamplesheathsheathsample流式細(xì)胞儀工作原理第44頁綜合三個系統(tǒng)功效-光學(xué)系統(tǒng)流式細(xì)胞儀工作原理第45頁螢光濾片流式細(xì)胞儀工作原理第46頁FACSCalibur光學(xué)系統(tǒng)488nm流式細(xì)胞儀工作原理第47頁綜合三個系統(tǒng)功效-電子系統(tǒng)流式細(xì)胞儀工作原理第48頁將光學(xué)訊號轉(zhuǎn)換成正百分比電子訊號。分析所輸出電子訊號，以脈沖高度、寬度、積分面積顯示。將量化訊號傳至電腦。電子系統(tǒng)流式細(xì)胞儀工作原理第49頁電子系統(tǒng)流式細(xì)胞儀工作原理第50頁電位脈沖之定量流式細(xì)胞儀工作原理第51頁訊號之產(chǎn)生與處理AmpGain1.0-9.99流式細(xì)胞儀工作原理第52頁TheUseofLinearAmplificatonAssumeweconvertlinearanalogsignalsusinga10bitADC--wehave1024channelsofrangecorrespondingto0-10V.Channeldifferenceis10V/1024=0.01V流式細(xì)胞儀工作原理第53頁IdealLinToLogConversion流式細(xì)胞儀工作原理第54頁試驗數(shù)據(jù)展現(xiàn)流式細(xì)胞儀工作原理第55頁15to20mmMonocyte10to14mmNeutrophil8to10mmLymphocyte散點圖反應(yīng)細(xì)胞形態(tài)

常見數(shù)據(jù)展現(xiàn)流式細(xì)胞儀工作原理第56頁直方圖分析匯報CV=S.D./Mean流式細(xì)胞儀工作原理第57頁散點圖分析匯報流式細(xì)胞儀工作原理第58頁FACSCalibur-復(fù)習(xí)流式細(xì)胞儀工作原理第59頁綜合三個系統(tǒng)功效流式細(xì)胞儀工作原理第60頁儀器之調(diào)試調(diào)整FSC/SSC散點圖以圈選目標(biāo)細(xì)胞群設(shè)閾參數(shù)及閾值調(diào)整螢光信號接收器FL1-4色差賠償流式細(xì)胞儀工作原理第61頁儀器之調(diào)試調(diào)整FSC/SSC散點圖以圈選目標(biāo)細(xì)胞群設(shè)閾參數(shù)及閾值調(diào)整螢光信號接收器FL1-4色差賠償流式細(xì)胞儀工作原理第62頁散射光信號調(diào)整流式細(xì)胞儀工作原理第63頁散射光信號調(diào)整流式細(xì)胞儀工作原理第64頁散射光信號調(diào)整

CellLine流式細(xì)胞儀工作原理第65頁儀器之調(diào)試調(diào)整FSC/SSC散點圖以圈選目標(biāo)細(xì)胞群設(shè)閾參數(shù)及閾值調(diào)整螢光信號接收器FL1-4色差賠償流式細(xì)胞儀工作原理第66頁閾值調(diào)整流式細(xì)胞儀工作原理第67頁儀器之調(diào)試設(shè)閾參數(shù)及閾值調(diào)整FSC/SSC散點圖以圈選目標(biāo)細(xì)胞群調(diào)整螢光信號接收器FL1-4色差賠償流式細(xì)胞儀工作原理第68頁自體螢光信號調(diào)整Single流式細(xì)胞儀工作原理第69頁儀器之調(diào)試設(shè)閾參數(shù)及閾值調(diào)整FSC/SSC散點圖以圈選目標(biāo)細(xì)胞群調(diào)整螢光信號接收器FL1-4色差賠償流式細(xì)胞儀工作原理第70頁Rememberthebasicassumptionofflowanalysis:ThesignalinFL1=thesignalfromFITCandonlyFITCandthesignalinFL2=thesignalfromPEandonlyPE.ThisisNOTTRUEfortherawdata!Theprocessbywhicheachfluorescencechannelis“corrected＂forthisspectraloverlapistermedFluorescenceCompensationFL1=FITC+x%PEFL2=PE+y%FITC螢光賠償調(diào)整(TheProblem)流式細(xì)胞儀工作原理第71頁螢光賠償調(diào)整FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(PE)FL1-%FL2(1830%)(01%)流式細(xì)胞儀工作原理第72頁螢光賠償調(diào)整(CompensationFitc)流式細(xì)胞儀工作原理第73頁螢光賠償調(diào)整(CompensationPe1)流式細(xì)胞儀工作原理第74頁螢光賠償調(diào)整(CompensationPe2)流式細(xì)胞儀工作原理第75頁螢光賠償調(diào)整(CompensationPerCP)流式細(xì)胞儀工作原理第76頁FACSCalibur各部結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞儀工作原理第77頁流式細(xì)胞儀工作原理第78頁流式細(xì)胞儀工作原理第79頁流式細(xì)胞儀工作原理第80頁檢體吸收區(qū)(SIP)DropletContainmentSystem包含：a.外管b.真空泵去除內(nèi)管內(nèi)前一個檢體殘留物c.上樣管(內(nèi)管)內(nèi)管(SIT)底座Balseal流式細(xì)胞儀工作原理第81頁FACSCalibur儀表板LO=12uL/minMED=35uL/minHI=60uL/minPRIME=Drain&FillSTANDBYRUN流式細(xì)胞儀工作原理第82頁正確開機程序開啟細(xì)胞儀電源。開啟其它周圍配置電源，如打印機及M.O.。開啟電腦。確認(rèn)鞘流液筒有八分滿FACSFLOW，旋緊。將廢液倒掉，并在廢液筒中加入100c.c.家用漂白水。將氣壓閥方向調(diào)在加壓（Pressurize）位置。排除液流過濾器中氣泡。使用1c.c.PBS為樣品，執(zhí)行PRIME功效兩次。HIGHRUN兩分鐘，即可開始分析樣品。流式細(xì)胞儀工作原理第83頁儀器清洗與關(guān)機正確步驟清洗步驟要確實：［尤其是使用PI之后］Prime(DrainthenFill)2X3X：沖洗Flowcell區(qū)FACSRinse(或generaldetergent)3ml -底座向右移，吸收約2ml：清洗外管

-底座移回中央，HighRun5min：清洗內(nèi)管內(nèi)管(SIT)