藥敏試驗(yàn)方法簡介

藥敏試驗(yàn)方法簡介第1頁/共72頁耐藥菌問題日益嚴(yán)重“目前藥物失去作用的速度與科學(xué)家發(fā)現(xiàn)新藥物的速度差不多?！? 摘自WHO報(bào)告第2頁/共72頁抗微生物治療面臨的困境抗藥性問題始終存在細(xì)菌不斷獲得新的耐藥機(jī)制以往對(duì)付耐藥性的策略收效不顯第3頁/共72頁第4頁/共72頁一、

抗菌藥物敏感試驗(yàn)（AST）預(yù)測抗菌治療的效果；指導(dǎo)抗菌藥物的臨床應(yīng)用；發(fā)現(xiàn)或提示細(xì)菌耐藥機(jī)制的存在，指導(dǎo)合理用藥，避免產(chǎn)生或加重細(xì)菌的耐藥；監(jiān)測細(xì)菌耐藥性，分析耐藥菌的變遷，掌握耐藥菌感染的流行病學(xué)，以控制和預(yù)防耐藥菌感染的發(fā)生和流行。第5頁/共72頁（1）抗菌藥物的選擇在我國主要遵循臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI）制定的抗菌藥物選擇原則A組：對(duì)特定菌群常規(guī)測試并報(bào)告的藥物B組：可常規(guī)測試、選擇性報(bào)告的藥物C組：替代性或補(bǔ)充性藥物U組：僅用于泌尿道感染的抗菌藥物第6頁/共72頁葡萄球菌屬抗菌藥物藥敏試驗(yàn)推薦分組葡萄球菌屬抗菌藥物A組苯唑西林（頭孢西丁紙片）、克林霉素、青霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、B組四環(huán)素、萬古霉素、利奈唑胺C組環(huán)丙沙星、慶大霉素、氯霉素、奎奴普汀/達(dá)福普汀U組氧氟沙星、呋喃妥因、磺胺異惡唑、甲氧芐啶第7頁/共72頁腸桿菌科抗菌藥物敏感試驗(yàn)推薦分組腸桿菌屬抗菌藥物A組氨芐西林、頭孢唑林、慶大霉素B組阿米卡星、奧格門丁、哌拉西林+他唑巴坦、頭孢呋新、頭孢吡肟、頭孢西丁、環(huán)丙沙星、亞安培南、哌拉西林、復(fù)方新諾明C組頭孢他啶、氯霉素、氨曲南、四環(huán)素U組羧芐西林、氧氟沙星、呋喃妥因第8頁/共72頁假單胞菌屬的抗菌藥物藥物敏感推薦分組假單胞菌抗菌藥物A組頭孢他啶、慶大霉素、哌拉西林B組阿米卡星、氨曲南、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、亞安培南、哌拉西林+他唑巴坦C組U組氧氟沙星第9頁/共72頁不動(dòng)桿菌屬的抗菌藥物藥敏試驗(yàn)推薦分組不動(dòng)桿菌屬抗菌藥物A組氨芐西林/舒巴坦、頭孢他啶、亞胺培南、環(huán)丙沙星、慶大霉素B組阿米卡星、哌拉西林+他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢噻肟、復(fù)方新諾明、哌拉西林、四環(huán)素第10頁/共72頁

腸球菌屬抗菌藥物藥敏試驗(yàn)推薦分組

腸球菌屬抗菌藥物A組氨芐西林、青霉素B組萬古霉素、利奈唑胺C組慶大霉素(120μg)、鏈霉素(300μg)U組環(huán)丙沙星、四環(huán)素、呋喃妥因第11頁/共72頁肺炎鏈球菌抗菌藥物藥敏試驗(yàn)推薦分組肺炎鏈球菌抗菌藥物A組青霉素、苯唑西林(1μg)、紅霉素、復(fù)方新諾明B組萬古霉素、克林霉素、四環(huán)素、氧氟沙星C組氯霉素、利奈唑胺第12頁/共72頁藥敏試驗(yàn)的折點(diǎn)亦遵照每年最新公布的CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，分為敏感（S）、耐藥（R）和中介（I）。第13頁/共72頁敏感：分離菌株能被測試藥物使用推薦劑量時(shí)在感染部位通?？蛇_(dá)到的抗菌藥物濃度所抑制耐藥：分離菌株不能被測試藥物常規(guī)劑量可達(dá)到的藥物濃度所抑制；分離菌株可能存在某些特定的耐藥機(jī)制；治療研究顯示藥物對(duì)分離菌株的臨床療效不可靠耐藥＝治療無效；敏感≠治療有效第14頁/共72頁二、抗菌藥物的種類及作用機(jī)制第15頁/共72頁三、藥敏試驗(yàn)方法學(xué)紙片擴(kuò)散法（K-B法）稀釋法（MIC法）肉湯稀釋法常量稀釋法微量稀釋法瓊脂稀釋法E-test法1.手工試驗(yàn)第16頁/共72頁2.自動(dòng)儀器藥敏系統(tǒng)

第17頁/共72頁紙片擴(kuò)散法（K-B法）原理：抑菌圈的大小反映受試菌對(duì)測定藥物的敏感程度，并與該藥對(duì)測試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)。第18頁/共72頁耐藥中介敏感RISLog2.MICd1d2抑菌圈直徑（mm)MIC與抑菌圈直徑的線性關(guān)系第19頁/共72頁準(zhǔn)備抗菌藥物紙片和水解酪蛋白（M-H）培養(yǎng)基；挑取孵育16～24小時(shí)已分純菌落，置于生理鹽水管中，振蕩混勻后校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)；第20頁/共72頁用無菌棉拭子蘸取菌液，在試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液，然后在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60度，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周；平板在室溫下干燥3～5min，用無菌鑷子或商品化的紙片分配器將含藥紙片緊貼于瓊脂表面；第21頁/共72頁35℃孵育16～24小時(shí)，量取抑菌圈直徑；根據(jù)抑菌環(huán)的直徑，按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀，報(bào)告敏感、中介、耐藥。第22頁/共72頁2023/4/2623CLSI對(duì)K-B法的標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)定紙片藥物含量、細(xì)菌接種濃度、培養(yǎng)基、平皿厚度、孵育時(shí)間、環(huán)境、判定標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控方法等；常規(guī)測試、報(bào)告的抗生素。不同的藥判定標(biāo)準(zhǔn)不同；不同的菌判定標(biāo)準(zhǔn)也不同。2023/4/26第23頁/共72頁擴(kuò)散法藥敏影響因素培養(yǎng)基pH值7.2-7.4營養(yǎng)程度（腸球菌能生長）厚度抗生素拮抗劑含量（用29212監(jiān)控）鈣鎂離子含量、鋅離子含量（用27853氨基糖苷類和亞胺配能結(jié)果監(jiān)控）菌懸液濃度高抑菌環(huán)縮?。倌退帲舛鹊蛣t擴(kuò)大（假敏感）細(xì)菌純度氣體環(huán)境普通細(xì)菌放CO2時(shí)由于碳酸的影響，藥物活性受到影響，形成假敏感或假耐藥苛養(yǎng)菌放普通環(huán)境生長不良，導(dǎo)致假敏感培養(yǎng)時(shí)間粘液性銅綠需48小時(shí)測量方法第24頁/共72頁稀釋法以一定濃度的抗菌藥物與含有受試菌的培養(yǎng)基進(jìn)行一系列不同倍數(shù)稀釋（通常為雙倍稀釋），培養(yǎng)16～24h后，通過觀察細(xì)菌生長現(xiàn)象來測得藥物對(duì)受試菌的最低抑菌濃度（MIC）。2023/4/26第25頁/共72頁稀釋法（MIC法）MIC法：分為常量法和微量法常量法：肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法微量法：微量肉湯稀釋法簡化雙濃度折點(diǎn)法ATB藥敏簡化常規(guī)濃度分布MIC法BD、德靈藥敏動(dòng)力學(xué)計(jì)算MIC法VITEK32、VITEK2藥敏第26頁/共72頁肉湯稀釋法不生長=抗生素抑制細(xì)菌生長生長=抗生素?zé)o法抑制細(xì)菌生長MIC(最小抑菌濃度)=抗生素可抑制細(xì)菌生長的最小濃度。.250.512481632MIC=8IncreasingAntibioticConc.第27頁/共72頁常量稀釋法藥敏試驗(yàn)的參考方法：

將標(biāo)準(zhǔn)接種物加入含対倍稀釋抗生素的MH肉湯管中.過夜培養(yǎng).MIC即是能抑制細(xì)菌生長的含最低抗生素的濃度的那一管所標(biāo)示的濃度值(瓊脂稀釋法是將対倍稀釋后的抗生素加入融化后平衡到50℃的MHA中再傾制平皿，接種物為一定大小的斑點(diǎn)，濃度也為104CFU/ml).解釋標(biāo)準(zhǔn)(SorR)是建立在體內(nèi)可達(dá)到的抗生素濃度水平上104cfu/ml4210.50.250.120mg/ml第28頁/共72頁微量肉湯稀釋法第29頁/共72頁第30頁/共72頁第31頁/共72頁接種后應(yīng)充分混勻，但不能有氣泡產(chǎn)生靜置培養(yǎng)培養(yǎng)溫度；35℃氣體環(huán)境：所有細(xì)菌（包括苛養(yǎng)菌）均置大氣環(huán)境；厭氧菌置厭氧環(huán)境；微需氧菌置微需氧環(huán)境；淋菌瓊脂稀釋法置CO2培養(yǎng)時(shí)間：18小時(shí)第32頁/共72頁藥敏結(jié)果報(bào)告可用MIC（μg/ml）或?qū)φ誄LSI標(biāo)準(zhǔn)用S、R和I報(bào)告。對(duì)于稀釋法的批量試驗(yàn)，有時(shí)需要報(bào)告MIC50、MIC90。2023/4/26第33頁/共72頁稀釋法藥敏影響因素培養(yǎng)基pH值7.2-7.4營養(yǎng)程度抗生素拮抗劑含量鈣鎂離子含量（鈣10-25；鎂10-12.5μg/ml）菌懸液（5×104CFU/ml）接種效應(yīng)濃度高M(jìn)IC抬高濃度低MIC壓低細(xì)菌純度氣體環(huán)境所有需氧細(xì)菌均放普通大氣環(huán)境。如果放CO2，由于碳酸的影響，藥物活性受到影響，形成假敏感或假耐藥培養(yǎng)時(shí)間真菌需48小時(shí)奴卡菌需5天第34頁/共72頁E-test法將稀釋法和擴(kuò)散法的原理結(jié)合起來，直接測定藥物對(duì)受試菌的MIC。2023/4/26第35頁/共72頁MIC值標(biāo)注于試條的光面Etest試條毛面貼于MHA上第36頁/共72頁Etest操作程序按照擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)操作涂布接種貼上試條并培養(yǎng)15-18小時(shí)讀取抑菌濃度并按標(biāo)準(zhǔn)解釋第37頁/共72頁

細(xì)菌生長區(qū)E試條細(xì)菌生長抑制區(qū)

25612880.16判讀MIC2023/4/26第38頁/共72頁

肺炎鏈球菌

青霉素MIC=3g/ml結(jié)果讀取第39頁/共72頁第40頁/共72頁BDPhoenixTM-100鳳凰全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏檢測系統(tǒng)最大的標(biāo)本容量：對(duì)100個(gè)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行鑒定與藥敏測試！第41頁/共72頁第42頁/共72頁第43頁/共72頁鑒定部分：51孔鑒定實(shí)驗(yàn)改良經(jīng)典實(shí)驗(yàn)顯色＋熒光檢測無需附加實(shí)驗(yàn)與試劑藥敏部分：85孔藥敏實(shí)驗(yàn)比濁＋氧化還原（專利）實(shí)測倍比稀釋MIC值藥物種類與濃度梯度最多耐藥機(jī)制檢測同步進(jìn)行封閉式設(shè)計(jì)，安全無泄漏先進(jìn)的鑒定/藥敏復(fù)合板設(shè)計(jì)第44頁/共72頁P(yáng)hoenixTM100鑒定板

革蘭氏陽性板、革蘭氏陰性板生化反應(yīng)組合革蘭氏陽性菌鑒定板革蘭氏陰性菌鑒定板鑒定部分：51孔鑒定實(shí)驗(yàn),改良經(jīng)典實(shí)驗(yàn)顯色＋熒光檢測,無需附加實(shí)驗(yàn)與試劑第45頁/共72頁第46頁/共72頁第47頁/共72頁鑒定實(shí)驗(yàn)方法在研究了上百種反應(yīng)底物基礎(chǔ)上，選擇了45種反應(yīng)底物。檢測板每20分鐘檢測一次Green,blue

andred檢測顯色反應(yīng)UVlight檢測熒光反應(yīng)panel第48頁/共72頁P(yáng)hoenix工作流程

從經(jīng)過夜純培養(yǎng)的新鮮平板上挑取菌落第49頁/共72頁P(yáng)hoenix工作流程

在ID肉湯中制成標(biāo)準(zhǔn)濁度（0.5~0.6麥?zhǔn)蠁挝唬┑木鷳乙旱?0頁/共72頁

加一滴AST指示劑到AST肉湯中

Phoenix工作流程第51頁/共72頁

從ID肉湯管中準(zhǔn)確吸取25L菌懸液，加入到AST肉湯中Phoenix工作流程第52頁/共72頁

將肉湯倒入檢測板，蓋蓋子。檢測板已準(zhǔn)備好，可以上機(jī)檢測。Phoenix工作流程巧妙的重力加樣技術(shù)第53頁/共72頁

掃描板條，輸入資料Phoenix工作流程第54頁/共72頁

將檢測板放入儀器（隨意位置）Phoenix工作流程第55頁/共72頁僅需區(qū)別革蘭氏染色即可選板板條種類齊全：

鑒定板、藥敏板、鑒定藥敏復(fù)合板同時(shí)提供獨(dú)立密封包裝的鑒定肉湯和藥敏肉湯，無需用戶配制。試劑常溫保存配套試劑第56頁/共72頁強(qiáng)大軟件支持：

BDXpert微生物專家系統(tǒng)幫助解釋和監(jiān)測檢測結(jié)果檢測結(jié)果分別可分別傳入LIS系統(tǒng)或BDEpicenter數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)或打印機(jī)，并能進(jìn)行各種統(tǒng)計(jì)學(xué)分析強(qiáng)大的軟件系統(tǒng)第57頁/共72頁鑒定能力

革蘭氏陽性菌鑒定>180種革蘭氏陽性球菌革蘭氏陽性桿菌

革蘭氏陰性菌鑒定>200種革蘭氏陰性發(fā)酵桿菌革蘭氏陰性非發(fā)酵桿菌無需附加實(shí)驗(yàn)95-96%準(zhǔn)確性鑒定時(shí)間

minimum 1:26hr maximum12:25hr average 3:24hr

median 2:26hr 95th% 6:26hr優(yōu)異的鑒定性能第58頁/共72頁檢測反應(yīng)孔內(nèi)微生物生長情況濁度（傳統(tǒng)方法）：微生物生長形成小顆粒和聚集成團(tuán)塊

氧化還原作用（BD專利技術(shù)）：通過藥敏實(shí)驗(yàn)指示劑顏色變化檢測微生物的新陳代謝濁度與氧化還原的變化通過紅、藍(lán)、綠光每20分鐘檢測一次

藥敏實(shí)驗(yàn)方法第59頁/共72頁藥敏種類與時(shí)間葡萄球菌屬鏈球菌腸球菌屬腸桿菌屬其他革蘭氏陰性桿菌GN-90%in5HrsGP-80%in6Hrs藥敏特點(diǎn)對(duì)倍稀釋藥物濃度真正的MIC檢測延遲耐藥檢測急診報(bào)告快速完成功能

耐藥檢測無需附加板條自動(dòng)檢測18種耐藥機(jī)制產(chǎn)超廣譜Beta內(nèi)酰胺酶檢測(ESBL)耐甲氧西林葡萄球菌檢測(MRS)鏈霉素高耐株檢測(HLSR)慶大霉素高耐株檢測(HLGR)耐萬古霉素腸球菌檢測(VRE)產(chǎn)Beta內(nèi)酰胺酶革蘭氏陽性菌檢測優(yōu)異的藥敏性能第60頁/共72頁儀器判讀結(jié)果儀器自動(dòng)記錄每次判讀的每個(gè)反應(yīng)孔的結(jié)果。將反應(yīng)結(jié)果與上一次判讀結(jié)果進(jìn)行比較。當(dāng)兩次結(jié)果沒有差別，則該反應(yīng)結(jié)束。內(nèi)置的運(yùn)算法則：顏色比率的變化依時(shí)間而變的數(shù)據(jù)庫：2、3、4、6、12小時(shí)，依據(jù)每個(gè)測試周期的判讀結(jié)果產(chǎn)生“百分比圖”，如獲得足夠的信息，則給出鑒定結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)菌量,可信度＞90％，給出結(jié)果。第61頁/共72頁BDXpert微生物專家系統(tǒng)鑒定實(shí)驗(yàn)BDXpert專家系統(tǒng)

-NCCLS-DIN-SFM-BDRules報(bào)告

-ID-MI-RulesetSIR-BDXpertSIR-特殊信息

藥敏實(shí)驗(yàn)第62頁/共72頁BDXpert微生物專家系統(tǒng)目的對(duì)藥敏結(jié)果進(jìn)行解釋與修正，保證藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，從而指導(dǎo)臨床正確進(jìn)行抗感染治療專家規(guī)則來自于：已確定的標(biāo)準(zhǔn)（NCCLS,DIN,SFM)藥物研發(fā)單位的文獻(xiàn)資料已廣為接受的文獻(xiàn)資料和經(jīng)驗(yàn)持續(xù)更新第63頁/共72頁BDXpert微生物專家系統(tǒng)規(guī)則的應(yīng)用SIR結(jié)果的解釋來自于專家系統(tǒng)規(guī)則的設(shè)置NCCLS,DIN,SFM,Custom藥物分級(jí)規(guī)則天然耐藥和天然敏感規(guī)則耐藥標(biāo)記規(guī)則腸桿菌科：ESBL葡萄球菌：MRS,beta-內(nèi)酰胺酶(GPBL)腸球菌：VRE,HLGR,HLSR第64頁/共72頁舉例：SIR解釋

規(guī)則規(guī)定腸桿菌科細(xì)菌Ampicillinbreakpoints: S8(I=16)R32Ref:Table2A(NCCLSM100-S12,2002)Phoenix顯示如果待檢菌是腸桿菌科細(xì)菌，且藥物為ampicillin，MIC=2那么結(jié)果顯示為“S”BDXpert微生物專家系統(tǒng)規(guī)則的應(yīng)用第65頁/共72頁舉例：天然耐藥規(guī)則規(guī)定規(guī)則：C.freundii

在體內(nèi)對(duì)ampicillin